实验专题模块三 血液生化检验  血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳  血清尿素氮的测定

 血液是在心脏和血管腔内循环流动的一种组织。成人的血液 约占体重的十三分之一，相对密度为 ～ ， pH 值为 7.3 ～ 7.4 ，渗透压为 313 mmol/L 。  血液由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白（白蛋白、球 蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、 激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。  利用生物化学的方法，检测存在于血液中的各种离子、糖类、 脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量， 叫做血生化检查。  在正常生理情况下，其各种化学成分的含量非常恒定。但是， 机体的生理变化和病理情况，可导致血液的某些化学成分的含 量发生较大的变化。所以分析血液的化学成分可以了解人体物 质代谢的状况，并协助诊断或者判断预后。  本专题将介绍血清蛋白与血尿素氮等两种生化指标的检测， 使同学们对临床生化检验有一个初步的了解。

实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 一、实验目的 1. 掌握分离血清蛋白的基本原理及其临床意义。 2. 了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关仪器的 操作。

二、背景与原理 血清蛋白的 pI 都在 7.5 以下，在 pH 为 8.6 的巴比妥缓 冲液中以负离子的形式存在，分子大小、形状也各 有差异。所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上 分离成 A 、 α1 、 α2 、 β 和 γ 五条区带。电泳结束后， 将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色， 再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别用 剪刀分离出来，将其溶于碱液中，进行比色测定， 最后计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后 的醋酸纤维薄膜透明处理后在扫描光密度计上绘出 电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百 分数。

+ 白蛋白 (A) α1 α2 βγ 血清蛋白的 pI 大多在 7.5 以下，在 pH8.6 的巴比妥缓冲液中以负离 子形式存在，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成 A 、 α1 、 α2 、 β 和 γ 五条区带。 蛋白名称等电点分子量 白蛋白 α5.06 α1 ： α2 ： β γ

 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有 用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂 蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。  醋酸纤维素薄膜经 1,4 －二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透 明，因而可得背景为无色的电泳图谱。 醋酸纤维素薄膜的特性

四、 实验操作 1. 准备与点样： 1 ） 将薄膜切成 2.5×8cm 的小块，在薄膜无光泽面距一 端 1.5cm 处用铅笔划一线，表示点样位置。 2 ） 将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上 （缓冲液盛于培养皿中），使膜条自然浸湿下沉。 3 ） 将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出， 用滤纸吸取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻 片上，使点样线空架。 4 ） 用血色素吸管吸取人新鲜血清 3 ～ 5ul ，涂于宽 2 厘 米的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯 中蘸一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜 点样线上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。

2. 电泳 : 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面 （即点样面）向下，点样端置于阴极。槽架上以四层 滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡 5 分钟后通 电，电压为 10V/cm 长（指膜条与滤纸桥总长度），电 流为 0.4 ～ 0.6mA/cm 宽，通电一小时左右关闭电源。 3. 染色 : 通电完毕后用镊子将膜取出，直接浸于盛有氨基黑 10B 的染色液中，染 5 分钟取出，立即浸入盛有漂洗液 的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用 滤纸吸干薄膜。

4. 定量： 取试管 6 支，编好号码，分别用吸管吸取 0.4N 氢氧化钠 4ml 。 剪开薄膜上各条蛋白色带，另一空白部位剪一平均大小的薄 膜条（作为分光光度法调零管），将各条分别浸于上色述试 管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计 进行比色，波长 650nm ，以空白薄膜条洗出液为空白对照， 读取白蛋白、 α1 、 α2 、 β 、 γ 球蛋白各管的吸光度值 A 。 5. 计算 : 光吸收总和 A 总 ＝ A A +A α1 +A α2+ A β +A γ 各部分蛋白质的百分数为： 白蛋白 %= (A A / A 总 )×100%;  1 球蛋白 %= (A α1 / A 总 )×100%;  2 球蛋白 %= (A α2 / A 总 )×100% ；  球蛋白 %= (A β / A 总 )×100% ；  球蛋白 %= (A γ / A 总 )×100%

临床意义  正常值： 白蛋白： 57 ～ 72% α 1 球蛋白： 2 ～ 5% α 2 球蛋白： 4 ～ 9% β 球蛋白： 6.5 ～ 12% γ 球蛋白： 12 ～ 20%  急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、 α 2 及 β 球蛋白减少， γ 球蛋白增高。  慢性肝炎： γ 球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。  肝硬化：白蛋白、 α1 、 α2 球蛋白均明显下降， γ 球蛋白极度升高， 甚至 A/G 比值倒置。  肾病综合征时，白蛋白降低， α 2 、 β 球蛋白升高。

实验二 血清尿素氮的测定 一、实验目的 1. 掌握血尿素氮的定义及其测定的意义。 2. 了解二乙酰一肟显色法的原理与操作。

二、背景与原理 尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。通常肾脏为排泄尿素的主要器官， 尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，因此在血液中会有少量 的尿素存在，一般用血尿素氮（ BUN ）来衡量。 肾小管内尿流速越快，尿素的重吸收就越少，也即达到了最大清除率。 如果肾功能出现了损害，则有可能导致尿素排出减少，或者是重吸收 增多，使得 BUN 升高。和血肌酐（ SCR ）一样，在肾功能损害早期， 血尿素氮可在正常范围。当肾小球滤过率下降到正常的 50% 以下时， 血尿素氮的浓度才迅速升高。正常情况下，血尿素氮与肌酐之比 （ BUN/Scr ）值约为 10.1 ，高蛋白饮食、高分解代谢状态、缺水、肾 缺血、血容量不足及某些急性肾小球肾炎，均可使比值增高，甚至可 达 20 ～ 30 ；而低蛋白饮食，肝疾病常使比值降低，此时可称为低氮质 血症。

血尿素氮的检测方法有很多，在本实验中我们将使用二乙酰一肟显色法。该 方法的原理是，尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物， 颜色深浅与尿素的含量成正比，可通过分过光度法获得尿素含量。因二乙酰 不稳定，故用二乙酰一肟来代替。二乙酰一肟与强酸作用，可产生二乙酰， 进而再与尿素反应，过程如下： 反应在强酸中进行，产生的羟胺是干扰物质，所以须用氧化剂将其氧化除去， 可用的氧化剂有过硫酸盐、砷酸、过氯酸、氯胺 T 以及一些阳离子等。另外， 在显色反应中产生的复合物存在着对光不稳定的问题。加入硫氨脲既能提高尿 素与二乙酰反应的灵敏度，又能增加其显色的稳定性。硫氨脲如果结合三价铁 离子或镉离子一起使用更能提高灵敏度。这样就可以进不除血清蛋白的超微量 尿素氮测定。

四、实验操作 试管编号 1234 尿素氮标准液 （ ml ） 1234 蒸馏水（ ml ） 5432 尿素氮的浓度 （ mg/100ml ）  系列标准溶液的配制  测定液的配制 试管编号 蒸馏水（ µL ） 分别从上表 1-4 管吸取液 体加入对应编号管（ µL ） 血清样品（ µL ） 20 酸性试剂（ mL ） % 二乙酰一肟（ mL ） 0.5

 混匀后置于沸水中水浴 12 分钟。  置冷水中冷却 5 分钟后，用 540nm 进行比色，以 5 号管作 为空白，读取各管光吸收读数。  将所得读数作纵座标与相应尿素氮浓度作横坐标在座标 纸上作图，绘成标准曲线  查标准曲线，得待测血清中尿素氮含量。

五、注意事项 1. 如血浆或血清尿素氮浓度超过 40mg 时，则 必须将标本用生理盐水稀释后再操作，结果 乘稀释倍数即可。

六、临床意义 1. 正常值范围： 5~19mg/100ml 2. 可能临床提示： 1 ）血液尿素浓度增高分生理性和病理性因素两方面。 A ．生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血 清尿素浓度男性比女性平均高 0.3 ～ 0.5mmol/L ，随年龄增加有增高倾向。 成人日间生理变异平均为 0.63mmol/L 。 B ．病理因素 a. 肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤 过率减低而致血液尿素浓度增加。 b. 肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾 炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。 c. 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如 前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。 2 ）血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功 能衰竭患者。

课堂分组讨论 患者女性， 47 岁，农民。因反复发作性昏迷半年，近发作 7 小时入院。体检：中度昏迷，肝未触及，无瘫痪体征。心电 监测以及头颅 CT 均未发现明显异常。立即使用甘露醇静脉 滴注， 3 小时后患者苏醒。追问病史，患者来自血吸虫病区， 3 年前因脾脏肿大行脾切除术。每次昏迷前均有进食高蛋白 食物史，但未引起重视。本次发病前在亲戚家进食鸡蛋两个， 烤鸭约半斤以及少量猪肉。肝功能检查：血氨 150umol/L ， 血清白蛋白 38.2g/L ，球蛋白 27.4g/L ，总胆红素 15.2umol/L,ALT 135U/L, AST 45U/L. 。 B 超显示，血吸虫性 肝纤维化。 问题讨论： 1. 患者高蛋白饮食与肝性脑病发病的关系如何？ 2. 肝性脑病的分子机制。