愈伤组织的培养  第一节 愈伤组织的诱导和分化  第二节 愈伤组织中的形态发生  第三节 人工种子

第一节 愈伤组织诱导和分化  已有特定结构与功能的植物组织，在一 定的条件下，细胞改变了原来的分化状 态，失去原有的结构和功能，转变为具 有分生能力的细胞，这个过程成为脱分 化。植物各种器官的外植体在离体的条 件下，细胞经过脱分化等一系列过程， 转变为分化细胞，继而转变成一种能迅 速增殖的无特定结构和功能的细胞团， 成为愈伤组织（ callus ）。

矮牵牛叶片诱导的愈伤组织

一．愈伤组织的诱导  1 ．一般认为，植物各器官和组织均有发 生愈伤组织的可能性。而且还认为愈伤 组织诱导成败的关键不在于植物材料的 来源，主要在于培养的条件。其中植物 生长调节剂是诱导愈伤组织成败的极为 重要因素。用于诱导愈伤组织形成的常 用激素是 2.4-D 、 IAA 、和 NAA ，所需浓 度在 0.01~10mg/L 范围内；常用的细胞分 裂素是激动素、玉米素和 6-BA ，使用的 浓度范围在 0.1~10mg/L 。

 2 ．很多情况下，单独使用 2.4-D 就可成功 地诱导愈伤组织的发生，不过要注意使 用的浓度，过低愈伤组织生长缓慢，过 高愈伤组织的生长完全受到抑制。生长 素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速 生长是必要的，特别是两者使用时能强 烈刺激愈伤组织的形成。  3 ．不同植物材料不同要注意使用不同种 类的激素和不同的浓度。

不同激素条件下水稻盾片愈伤组织的诱导情况

二．愈伤组织的形成  愈伤组织的形成大致经过起始期、分裂期和形 成期。  1 ．起始期。是指细胞准备进行分裂的时期， 当外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下， 通过脱分化启动而进入分裂和形成愈伤组织。 细胞内的 RNA 含量明显增加，细胞核也变大。  2 ．分裂期。分裂期的特征表现为外层细胞出 现分裂，使得外层细胞变小并逐渐回复到分生 组织状态，在这个过程中细胞分裂进入最旺盛 时期，细胞体积最小，核仁和细胞核较大， RNA 含量最高。

 3 ．形成期。进入形成期的特征是细胞大 小趋于稳定，细胞分裂从分裂期的周缘 细胞分裂为主转向了内部的组织，随着 愈伤组织表层细胞分裂的停止和缓和， 内部深处的细胞开始分裂并形成象维管 束或类似分生组织组成的鸟巢状结构。  所要注意的是，不同植物来源的愈伤 组织，在质地、形态和物理性状方面均 有明显的差异。同一植株不同器官形成 愈伤组织的能力不同。

第二节 愈伤组织中的形态发生  愈伤组织通过再分化形成再生植株的方 式主要有三种：  （ 1 ）先产生芽后在茎的基部长根；  （ 2 ）先长根再长芽；  （ 3 ）愈伤组织的不同部位分别形成根和 芽。

一．愈伤组织器官的形成  一般愈伤组织开始分化时，由大小不等 的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞， 保持相对稳定状态。在芽分化时，从愈 伤组织的表层开始，属外起源；但根发 生在愈伤组织的深处，与整体植株发生 类似，是内起源。愈伤组织的外部形态 业随分化而改变，一般右疏松转向紧密。

 1. 植物生长调节物质在分化过程中的作用是极 为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分 化中起着重要的作用。如仙人掌科的金牛掌茎 段培养中，当 6—BA 的浓度（单位为 mg·L -1 ） 的 50 ～ 100 倍时，茎段的愈伤组织可以再分化 出仔球，而 6—BA 浓度过高（ 150 倍）或过低 （ 10 倍）则无仔球形成。大量试验结果表明， 大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分 化的植物激素控制理论，即当生长素与细胞分 裂的比例高时，愈伤组织仅形成根，生长素与 细胞分裂素的比例小时则产生苗，而两种激素 的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织 。

 2. 在许多木本植物愈伤组织形成再生苗的培养 过程中，常常时将诱导不定芽与诱导根两步完 成。即首先利用分化培养基（含有 6 — BA ， CPPU ， KT ）使愈伤组织形成不定芽。增加繁 殖系数；当不定芽长大出现叶片后，再将伸长 的苗从基部切下转入含生长素类（如 IBA ， NAA ）的生长根培养基上培养诱导根生成。这 是一种较为常见的器官发生方式。如研究芦荟 的无性快速繁殖时，首先用 MS 培养基附加不 同的 6—BA ，促进不定芽的形成（表 5—3 ）， 然后将抽枝的小植株转移到 MS 附加不同浓度 的 NAA 培养基上培养，诱导根的发生和生长。

二．体细胞胚胎发生  1. 体细胞胚。大量实验证实，植物体细胞具有 成胚的潜力，由体细胞发育成胚状体（ somatic embryo ）。在含有椰子汁的培养基上，石龙芮 花器官各部分以及体细胞组织都能形成愈伤组 织，之后三周内，在愈伤组织上出现大量胚， 这些胚是由愈伤组织外层细胞以及深部细胞起 源的。后来证实通过细胞培养或由愈伤组织得 到的单细胞，以及原生质体培养后，都能形成 胚性愈伤组织（ embryonic callus ）。在离体或 活体条件下，体细胞经原胚期、球形胚期、心 性胚期、鱼雷胚期和子叶期等阶段形成的胚叫 体细胞胚状体（ somatic embryoid ）。从愈伤 组织或外植体的表面产生胚状体的情况较为常 见。

 2. 体细胞胚状体在发育早期的特征。在非洲紫 罗兰叶片培养过程中，叶片逐渐变大、肥厚， 形肿胀突起，表面逐渐出现密集的小突起，它 同芽点不同，初为淡绿色，逐渐转绿，呈球形 小点，用显微镜观察，可到叉状对生的子叶原 基。有些胚状体容易从形态、发生数量等方面 加以观察区分出来的，但有些胚状体在发育的 早期与发育的芽难以区分。 1971 年， Haccius 提 出鉴别胚状体的标准：（ 1 ）胚状体具有极性， 出现茎端和根端，是一种单极性结构；（ 2 ） 在组织学上，胚状体的维管组织分布呈 “Y” 字 形，一般与愈伤组织或外植体的维管组织无联 系。

蝴蝶兰叶片诱导产生原球茎（ PLB ） ---PLB 的实质为体细胞胚胎的一种形式

三. 体细胞胚状体诱导和植株再生  培养基成分中的生长素在体细胞胚胎发 生中起重要作用；  2.4-D 对胚胎成熟过程起抑制作用，其作 用机制可能是通过内源乙烯引起的；  培养基中的氮源形态也会显著影响离体 条件下的胚胎发生 ；  培养基以液体优于固体 ；  体细胞胚常常能在原来的培养基上成熟 和萌发 ，形成植株。

第三节 人工种子  人工种子（ artificial seed ）是将植物离体 培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成 分和保护功能的物质中，在适宜的条件 下发芽出苗的颗粒体。人工种子包括体 细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分。 其最外层为有机的簿膜包裹，以保护水 分丧失和防止外部的物理力量的冲击， 中间含有培养物所需的营养成分和某些 植物激素，以作为胚状体萌发时的能量 和刺激因素，最里面是胚状体或芽。

 一. 胚状体成熟培养。胚状体诱导成功后必须转 入成熟培养基培养，使它们同步增殖并达到成 熟，才可用于制备人工种子。 ABA 有助于体细 胞胚中脂肪、淀粉和蛋白质的积累，有利于生 长。  二. 人工种皮。人工种皮一直是人工种子研究的 主要热点之一。海藻酸钠、明胶、琼脂、果胶 酸钠等都可作内种皮，其中以海藻酸钠最好而 被广泛应用。  三. 人工胚乳。人工胚乳是由促进胚状体发育成 苗所必须的养分和碳源组成的。它包括营养元 素、蔗糖、植物激素、杀虫剂、杀菌剂、除草 剂等。人工胚乳是制备人工种皮时一起加入的。