基因导向的个体化给药 在医院临床药学中的应用 青岛大学附属医院 药学部 隋忠国 2016.5.21

主要内容 1 基因导向的个体化给药的发展历程与作用 2 基因导向的个体化给药在我院临床药学中的应用 3 卫计委加强基因测序管理要点

一、基因导向的个体化给药的发展历程与作用

2006 1990 1953 1865 后基因组 时代开启 人类99.99% 基因测序完成 美英法德日中 沃森、克里克 孟德尔 提出遗传因子 1865 沃森、克里克 DNA双螺旋结构 1953 美英法德日中 人类基因组计划 1990 人类99.99% 基因测序完成 2006

比较基因组学 功能基因组学 蛋白质组学 结构基因组学 代谢组学 药物基因组学 后基因组时代研究的重要方向

药物基因组学的诞生 1997年6月,Abbott-Genset（雅培-基赛） 两大公司共同成立 世界上第一个基因与制药公司研究药物基因组学, Abbott-Genset Alliance 的诞生,标志着药物基因组学时代的到来。 药物基因组学，又称基因组药物学或基因组药理学，是药理 学或基因组学的一个分支。它是研究基因组或基因变异对药物在人 体内吸收、代谢、疗效及不良反应产生影响的现象及其机制，从而 指导新药开发和合理用药的一门新学科。

药物基因组学的意义 基因多态性是药物基因组学的基础和重要研究内容 药物基因组学 药物基因组学不是以发现人体基因组基因为主要目的 相对简单地运用已知的基因理论改善病人的治疗 以药物效应及安全性为目标，研究各种基因变异与药效及安全性的关系 药物基因组学 药物转运蛋白 药物代谢酶 药物作用靶点 基因多态性是药物基因组学的基础和重要研究内容

单核苷酸多态性（SNP）是个人间最小的遗传差异 导致人类药物代谢和反应差异的主要原因 46个染色体组装的。三十亿个碱基对，有超过3百万（每一千中有 一个）单一碱基对的变化。这称为单核苷酸多态性SNP 10q24.2 Chromosome 10 CYP2C9 gene 9 Exon 55kb 490 AA C G T A SNP CYP2C9*2 No enzymatic activity Cys GT突变

等位基因一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因。当一条染色体上的等位基因发生突变了，就会形成突变型杂合子。两条染色体上的等位基因均发生了突变就会形成突变纯合子。

BaiO 药物作用受药物代谢、转运、靶点多态性控制。 基因组 药代动力学 药物代谢酶 基因变异 (单核苷酸多态性) 药物转运体 药物靶点 药效动力学 药物疗效和毒性的个体差异

BaiO 基因多态性 药物作用多样性 个体差异 基因水平 个体化用药 药物基因组学 基础 遗传多态性 药物代谢酶 药物转运体 药物受体 药物靶标 内容 揭示差异的遗传特征 鉴别基因序列的差异 研究药物作用的差异 研究基因突变与药效及安全性的关系 目的 改善病人用药 提高用药安全性有效性 减少药物不良反应 基因多态性 药物作用多样性 个体差异 基因水平 个体化用药 药物基因组学

BaiO 个体化用药 遗 传 身高/体重 性 别 环境因素 饮食 吸烟 合并用药 年 龄 老年人 儿童 新生儿 脏器功能 药物反应个体差异 遗 传 性 别 环境因素 饮食 吸烟 合并用药 年 龄 老年人 儿童 新生儿 个体化用药重点需要考虑与药物反应个体差异相关的各种因素，包括…等。随着药物基因组学研究的不断深入，遗传差异即基因多态性导致的个体差异映入眼帘，基因导向的个体化给药在临床上扮演者越来越重要的角色。 脏器功能 药物反应个体差异 肝功能 肾功能 心功能 并 发 症 病 程

根据个人精细的基因组信息，对疾病实行早期查出，终生量体裁衣预防和治疗疾病的医疗保健模式。 BaiO 基因导向的个体化给药 A lifelong, individually tailored health care approach to the detection, prevention and treatment of disease based on knowledge of an individual's precise genetic profile. 根据个人精细的基因组信息，对疾病实行早期查出，终生量体裁衣预防和治疗疾病的医疗保健模式。

BaiO 个体化医学——4P医学中的先行领域 Preventive Predictive 预防 预测 participatory 生活方式的改变和 避免危险因素 疫苗 疗养 重点在提前干预 Preventive 预防 Predictive 预测 疾病率—DNA 序列 定期体检 P1 P2 P4 P3 根据个体的独特遗传变异, 选择合适药物和合适的剂量，开发针对独特遗传变异人群的药物 病人了解疾病并 参与用药选择 participatory 参与 Personalized 个体化

基因导向的个体化给药优势 传统的医疗模式下，临床医师对症选择某种药物并按照规定给予常规治疗，其药物和剂量的选择是否合适此病人只能在用药后进行判断。 基因导向的个体化给药模式下，临床医师可以根据病人的基因型资料实施给药方案，以提高疗效、减少不良反应，同时减轻病人的痛苦和经济负担。

循证医学 个体化用药 病人 A 药 ADR B 药 分子诊断 目标药 健康体系 疗效不同-浪费资源和时间 常见和不可预知的药物不良反应 量体裁衣治疗 提高疗效，减少不良反应 健康体系

二、基因导向的个体化给药在我院临床药学中的应用

机遇： 医改提出医药分家，成立药物基因组学为药剂科成立了新的学科，真正实现临床药师的价值。 实验室的建立 机遇： 医改提出医药分家，成立药物基因组学为药剂科成立了新的学科，真正实现临床药师的价值。

2012.9.5成立中南大学湘雅医学检验所青岛分中心

测序仪 生物安全柜

本检验所汇集了中南大学湘雅一流的专业技术力量与高端 医疗资源，整合了个体化医学倡导者工程院院士周宏灏领 衔的个体化医学研究团队，为社会提供权威的常规医学检 测服务。 目前专业于基因导向肿瘤、痛风病、器官移植、糖尿病、 高血压、心脑血管疾病等个性化药物治疗的临床研究、应 用和推广。

检测项目举例 1. HLA-B*5801检测与别嘌呤醇 作用：HLA（人类白细胞抗原）是人类主要组织相容性 复合体的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞间的相 互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答。 突变型：在使用别嘌呤醇的病人中，凡是产生皮肤不良 反应者，100%会有HLA-B*5801基因变异。 用药指导：携带HLA-B*5801 等位基因者慎用别嘌呤醇， 以免引起皮肤不良反应。 月平均基因检测量：50例左右

痛风患者的基因检测和个体化给药 别嘌呤醇为次黄嘌呤氧化酶抑制剂，能够减少尿酸合成并降低血中尿酸浓度，是治疗痛风的首选药物。但该药引起的严重药疹临床屡见报道，是最易引起严重药疹的药物之一 非布司他为2-芳基噻唑衍生物，是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过抑制尿酸合成降低血清尿酸浓度。价格较别嘌呤醇高 安全 经济

别嘌呤醇与HLA-B 随着人类基因组学和药物基因组学研究的不断深入，一些药物所致严重皮肤反应与人类白细胞抗原B（human leucocyte antigen-B，HLA-B）基因多态性的关系得到了揭示

别嘌呤醇与HLA-B

别嘌呤醇与HLA-B

别嘌呤醇与HLA-B

HLA-B*5801等位基因与别嘌呤醇药物引起严重不良反应具有统计学关联性 Meta-analysis图

我院开展HLA-B基因检测 诊断 检测基因 总例数 携带HLA-B*5801例数 是否可用别嘌呤醇 痛风 HLA-B 2070 206 否 未携带HLA-B*5801例数 1864 是 临床研究表明HLA-B*5801 与别嘌呤醇所致Stevens-Johnson 综合症，中毒性表皮坏死松解症显著相关 如患者携带HLA-B*5801 等位基因，不建议使用别嘌呤醇

HLA-B*5801等位基因检测与个体化用药流程 患者初次门诊 HLA-B*5801等位基因检测 患者复诊 别嘌呤醇（HLA-B*5801阴性） 患者用药 非布司他（HLA-B*5801阳性）

检测项目举例 2. CYP 2C9、VKORC1检测与华法林 作用：华法林主要由CYP2C9代谢，抗凝作用由维生素K 环氧化物还原酶复合物亚单位1（ VKORC1 ）酶介导。 突变型： CYP2C9 基因突变导致华法林代谢减慢，抗凝 作用增强； VKORC1基因 突变增强VKORC1 酶对华法 林的敏感性，抗凝作用增强。 用药指导：发现携带突变等位基因的患者给与相对低的 华法林剂量。 月平均基因检测量：20例左右

检测项目举例 3. CYP 2C19检测与氯吡格雷 作用：CYP2C19是氯吡格雷重要的体内代谢酶。 月平均基因检测量：15例左右

检测项目举例 4. GPIa检测与阿司匹林 作用：血小板胶原受体血小板膜糖蛋白Ia/IIa ( GPIa/IIa ) 密度增加可能是血栓形成的潜在危险因素和阿司匹林抵 抗的原因。 突变型：GPIa基因多态性可以增加血小板膜胶原受体的 密度，从而降低阿司匹林疗效。 用药指导：发现携带突变等位基因的患者增加阿司匹林 的剂量。 月平均基因检测量：15例左右

检测项目汇总 药物 项目名称 临床意义 治疗建议 标本 报告时间 β1受体阻断药 β1肾上腺素受体基因多态型 预测疗效 不同基因型的患者，对美托洛尔的反应不同，应根据β1肾上腺素受体不同的单倍型，调整剂量或换药 血液 3个工作日 CYP2D6 基因多态型 预测疗效和毒副作用 基因突变的患者，疗效降低，毒副作用增强；建议降低剂量或换药 利尿药 NPPA基因多态型 基因突变患者，对利尿药的反应敏感，治疗作用好；突变患者建议使用利尿药 钙离子拮抗剂 基因突变患者，对钙离子拮抗剂的反应差，治疗作用降低；而非突变患者，使用钙离子拮抗剂，治疗作用好；非突变患者，建议使用钙离子拮抗药 CYP3A5 基因多态型 基因突变患者，药效降低，建议增加剂量或换药 他汀类药物 HMGCR 基因多态型 突变患者，疗效增加；突变患者中，建议使用该药 SLCO1B1 基因多态型 预测毒 在基因突变的患者中，建议降低用药剂量或换用其它降脂药物 副作用 ApoE 基因多态性 ApoE存在多种等位基因型，不同的等位基因型对他汀类疗效的反应不一；建议根据不同基因型调整他汀的给药剂量或者换用其它的降脂药物 心衰治疗药物 基因突变患者，在使用心衰治疗药物后，疗效和预后均较好；在非突变患者中，建议加大心衰治疗药物的剂量

药物 项目名称 临床意义 治疗建议 标本 报告时间 ACEI类药物 ACE 基因多态型 预测疗效 ACE野生纯合子基因携带患者对依那普利、咪达普利的敏感性高于贝那普利和福辛普利，建议优先使用依那普利和咪达普利；杂合子基因携带患者对各种ACE抑制剂的敏感性相差不大，可根据临床具体情况加以选择；突变纯合子基因携带患者对贝那普利和福辛普利的敏感性高于依那普利、咪达普利，建议优先使用贝那普利和福辛普利。此外，ACE 野生纯合子基因携带患者还对AT1受体阻断药依贝沙坦敏感，建议使用 血液 3个工作日 AT1受体阻断药(洛沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦) CYP2C9基因多态型 预测疗效和毒副作用 野生型纯合子基因携带患者建议使用常规剂量洛沙坦、缬沙坦和厄贝沙坦；突变型杂合子基因携带患者和突变型纯合子基因携带患者不推荐使用洛沙坦，使用其它AT1手提阻断时采用低剂量，以防出现低血压等毒副反应 硝酸甘油 ALDH2 基因多态性 突变导致酶活性降低，硝酸甘油生物转化成NO经少，疗效降低；建议根据基因性的不同调整给药剂量。 氯吡格雷 CYP2C19基因多态型 基因突变患者，建议增加剂量，以达到预期疗效 华法林 CYP2C9 预测疗效和不良反应 突变患者，酶活性降低，建议降低药物使用剂量 VKORC1 预测不良反应 该基因的突变导致对华法林敏感性增加，必须降低剂量以防不良反应

磺脲类 （甲苯磺丁脲 格列吡嗪 格列美脲 格列喹酮 格列本脲） 噻唑烷二酮类 （曲格列酮 罗格列酮 吡格列酮） 药物 项目名称 临床意义 治疗建议 标本 报告 磺脲类 （甲苯磺丁脲 格列吡嗪 格列美脲 格列喹酮 格列本脲） CYP2C19 基因多态性 预测疗效和毒副作用 突变患者，酶活性降低，建议降低用药剂量 血液 3个工作日 TCF1 基因多态性 预测疗效 突变患者，对该类药物具有较高的敏感性，建议使用该类药物 KCNJ11和ABCC8 基因多态性 此两基因突变患者，对该类药物具有较高的敏感性，建议使用该类药物 TCF7L2基因多态性 基因突变患者，治疗成功率降低，建议换药 双胍类 （二甲双胍 苯乙双胍） 1-Oct 基因突变，导致转运功能降低，该类药物清除率变慢，降糖效应减弱；在突变患者中，建议加大用药剂量或换药 2-Oct 基因突变，导致转运功能降低，该类药物经肾清除减慢，降糖效应增加；建议降低用药剂量 噻唑烷二酮类 （曲格列酮 罗格列酮 吡格列酮） apMl 脂连素基因的多态性对该类药物的药效学结果可产生显著影响；在使用该类药物时，建议根据不同的基因型调整剂量 PPARr 基因突变患者，药物敏感性增加，降糖作用增强，同时毒副作用增加；建议降低用药剂量或换药 氯茴苯酸类 （瑞格列奈 那格列奈） SLCO1B1 基因突变导致该基因转运作用降低，该来药物代谢清除速率减慢，降糖效应增强，同时毒副作用也有可能增加；建议在突变患者中，降低该类药物的用药剂量

检测报告 检测报告模式

检测位点统计 检测位点统计

涉及基因情况 2015.11各基因所占的份额（除CYP3A4） 每年创造效益400万。 序数 基因 检测量 Num 1 CYP3A4 20327 Num 2 HLA-B 444 Num 3 CYP2C9 201 Num 4 GpⅠa 158 Num 5 HBV 138 Num 6 CYP2C19 134 Num 7 21基因 120 Num 8 C-KIT 108 Num 9 VKORC1 104 Num 10 TPMT 64 Num 11 52 Num 12 PDGFRA 48 Num 13 CYP3A5 33 Num 14 MTHFR 25 Num 15 CYP2D6 24 Num 16 19 Num 17 EGFR 16 Num 18 4 Num 19 UGT1A6 3 2015.11各基因所占的份额（除CYP3A4） 每年创造效益400万。

与中南大学湘雅医学院我国药物基因组学的奠基人周宏灏院士合作 科研平台建设 科研平台 对外 与中南大学湘雅医学院我国药物基因组学的奠基人周宏灏院士合作 对内 成立分子诊断与个体化用药重点实验室 湘雅药学专家来我院学术交流

成立分子诊断与个体化用药重点实验室 基础检测工作 科研平台建设 恶性肿瘤分子与转化医学研究平台 器官移植中心个体化用药与治疗平台 痛风病个体化用药与防治研究平台 月平均基因检测量50例左右 基因导向的用药指导临床接收率>90% 发表SCI论文多篇

学术水平 目前承担 承担课题情况 国家自然科学基金项目1项 山东省自然科学基金项目2项 山东省卫生厅课题1项 山东省教育厅课题1项 青岛市科技局课题5项 目前承担

学术水平 学术宣教情况 专业委员会的建立 学术交流会 科室宣讲会 成立山东省个体化用药委员会 每年定期召开会议，沟通交流近期药物基因组学进展及发展方向 科室宣讲会 医院的大部分科室开展了学术讨论会

学术水平 下一步发展方向 扩大检测涉及的药品范围 真正做到前验式的个体化医学 药物模型的建立 扩大宣传力度 美国FDA提出近160种药物与基因标志物有关，我们要逐步对这些药品相关的基因进行检测 真正做到前验式的个体化医学 将基因分型切实用于临床，将病人按基因型进行分组后治疗 药物模型的建立 进行临床科研，确立药物的剂量调整模型 扩大宣传力度 利用个体化医学分会举办学术活动

三、卫计委加强基因测序管理要点

学术水平 我国基因测序现状混乱 收费混乱。目前国内基因检测项目没有纳入临床检测范畴，所以也没有收费标准，有时候同一个检测的价格可以相差数千元之多。 从业人员混乱。基因检测的从业人员需要具有医学背景，但现实状况都是很多学生物出身的人在做，从业背景的混乱导致检测过程不规范，即便是同一份标本，做出来的报告也五花八门，检测结果不够准确。 检测仪器、诊断试剂混乱。很多基因测序仪未通过国家食品药品监管部门的审批注册，有的批件过期。 基因测序的使用范围混乱。

学术水平 卫计委加强对基因检测的管理

国家卫生计生委医政医管局关于印发《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》和《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》的通知 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 2015-07-31  国卫医医护便函〔2015〕240号 确立药物基因组学地位

药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。 指南指出： 药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。 药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可通过影响药物的体内浓度和敏感性，导致药物反应性个体差异。 药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。 指南旨在为个体化用药基因检测提供一致性的方法。

学术水平 何以规范基因测序 检测仪器、软件、诊断试剂需要通过国家食品药品监管部门的审批注册。 成立基因测序临床应用试点单位。 国家将重新制定相关的准入标准和管理规范。 个体化用药 科学家 病人 医生 药剂师 群众 政府 制药业

标本的种类 全血和骨髓标本 组织标本 口腔脱落细胞

质量保证 室内质量控制操作程序（SOP） 参加室间质评或实验室间比对 核心技术PCR 《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》

九大检测方法 PCR-直接测序法 PCR-焦磷酸测序法 荧光定量PCR法 PCR-基因芯片法 PCR-电泳分析 PCR-高分辨率熔解曲线法 原位杂交（ISH）

PCR-直接测序法 PCR-Sanger测序该方法属于定性检测。 优点是测序长度较长，可发现新的变异位点。 主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。

实时荧光PCR法 实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。 但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。本方法主要适于对少量位点、大样本进行分型。 目前CFDA已批准CYP2C9、VKORC1等多种基因多态性检测的PCR-荧光检测试剂盒。

PCR-基因芯片法 其主要优点是可同时对多个待测SNP位点进行检测。 我国CFDA已批准多种用于药物代谢酶和药物作用靶点基因如ALDH2、CYP2C9、CY2C19、CYP2D6、ADR1、ACE、VKORC1多态性检测的基因芯片试剂盒。

等位基因特异性PCR （Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR） 该方法可以用于检测各种类型的SNP，其优势是灵敏度高，特别适合于对肿瘤组织中的体细胞突变进行检测；缺点是假阳性率较高。

PCR-焦磷酸测序法 要优点：检测灵敏度较高，对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异。 主要缺点：对试剂和仪器有特殊要求，不易普及； 测序长度仅100bp，不能对长片段进行分析。

原位杂交技术的基本原理 利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。 1.两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子 2.应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P，荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质)DNA或 RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交 3.用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在与定位

原位杂交（ISH）法 为病理学检测，需要在特殊显微镜下判断。 分为亮视野原位杂交和荧光原位杂交（FISH）。

基因类型 SNP RNA dMMR（错配修复蛋白缺失） MSI（微卫星不稳定） 甲基化

检测体系的性能验证 《个体化医学检测质量保证指南》所有试剂都需进行性能评价： 个体化医学分子检测包括定性检测和定量检测 要求试剂取得CFDA注册证 严格标准操作规程（SOP）的自配试剂（LDT） 个体化医学分子检测包括定性检测和定量检测 定性检测的性能验证指标主要包括重复性/精密度、准确度（突变型的检测能力）、分析特异性、检出限等，可参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）的EPl2一A2文件进行。 定量检测监测体系性能验证的指标主要包括准确度、精密度、线性、可报告范围、检出限、参考区间、灵敏度、特异性等。

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析 一是根据个体的遗传信息调整用药剂量，以增加药物疗效，减少药物不良反应的发生； 二是根据个体的遗传信息确定用药的种类，避免应用针对特定基因型个体无效或可能产生严重药物不良反应的药物

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目 国际及国内证据确凿，意义明确的基因。有些指南提出了几百种基因，这是极其不严谨的。 除了以往公认SNP、mRNA表达、蛋白表达外，增加关于表观遗传学方面的检测，如甲基化、MSI等

列出25种基因 ALDH2*2多态性检测 错配修复蛋白缺失（dMMR）检测 CYP2C9*3多态性检测 CYP2C19*2和*3多态性检测 CYP2D6*10多态性检测 CYP3A5*3多态性检测 CYP4F2*3多态性检测 VKORC1 -1639 G>A多态性检测 DPYD*2A等位基因检测 G6PD基因多态性检测 HLA-B位点等位基因检测 IFNL3多态性检测 慢型NAT1/NAT2基因型检测 SLCO1B1 521T>C多态性检测 TPMT多态性检测 UGT1A1多态性检测 ACE I/D多态性 ADRB1多态性检测 APOE多态性检测 ANKK1 rs1800497多态性检测 G6PD基因多态性检测 HLA-B位点等位基因检测 IFNL3多态性检测 错配修复蛋白缺失（dMMR）检测 PML-RARα融合基因检测 TOP2A基因异常（基因扩增或基因缺失）检测 ERCC1 mRNA表达检测 RRM1 mRNA表达检测

个体化医疗检测内容 定性 分子 诊断 定量 修饰 mRNA水平 蛋白质水平 4. 基因表观遗传学 1. 基因多态性 2. 体细胞基因突变 SNP 基因分型 基因表达水平 DNA甲基化修饰 体细胞 基因突变 1. 基因多态性 2. 体细胞基因突变 3. 基因表达水平 mRNA水平 蛋白质水平 4. 基因表观遗传学 定性 定量 修饰

个体化药物伴随诊断 个体化药物伴随断包括 应用 反映: Variability in drug efficacy and toxicity SNP of gene gene mutation, expression of gene(mRNA and protein) 应用 SNPdrug metabolism Mutationdrug target mRNA or Proteindrug metabolism 反映: Variability in drug efficacy and toxicity 技术 SNP and mutation: Sequencing， Realtime PCR，Realtime PCR+HRM， Realtime PCR+ARMS，PCR+RFLP，PCR+SSCP mRNA：Realtime RT-PCR

小结与展望 基因导向的个体化给药是临床药学发展的新机遇和新使命，随着芯片技术的不断进步、样本数量的不断累积，高通量平台成本的降低，以及多候选基因的联合研究，必然可以让药物基因组信息服务于临床药物治疗，使患者因此而受益，为实现个体化用药迈出实质性的步伐。

感谢聆听！