化学家认识世界的光谱方法 张新祥 zxx@pku.edu.cn 从活体细胞监测到文物无损分析 化学家认识世界的光谱方法 张新祥 zxx@pku.edu.cn

自我介绍 1981－1985 北京大学技术物理系 1985－1991 武汉大学化学系 1991－ 北京大学化学学院 1981－1985 北京大学技术物理系 1985－1991 武汉大学化学系 1991－ 北京大学化学学院 1993 副教授 2000 教授 1993年开始 仪器分析主讲教员 研究方向：毛细管电泳－免疫分析 单细胞分子行为的分析方法研究

美丽的水母

● GFP的发光原理 美丽的珊瑚虫

The Discovery and Development of the Green Fluorescent Protein,（GFP ）绿色荧光蛋白 2008诺贝尔化学奖 Osamu Shimomura 1960s Martin Chalfie 1990s Roger Y. Tsien’s, http://nobelprize.org

Osamu Shimomura（下村修） Martin Chalfie Roger Y. Tsien 2008年的化学Nobel奖 Osamu Shimomura（下村修） Martin Chalfie Roger Y. Tsien 名古屋大学 Yale Cambridge 美国科学家

1962年 ,下村修(Shimomura O.)等分离纯化了水母中发光蛋白水母素 ,并发现一种绿色的荧光蛋白。 1974 年 , 分离纯化,称绿色蛋白 ,以后称绿色荧光蛋白 ( GFP) [ 1 ] 。 下村修的主要贡献在于发现 了绿色荧光蛋白。但是 ,他对 GFP的应用前景不敏感 ,也未意识到应用的重要性。 图1 水母 [1] Shimomura O , Johnson FH, Saiga Y Aequorea . J Cell Comp Physiol, 1962, 59: 223 - 239.

2008年的化学Nobel奖 荧光蛋白发现 下村 修 约翰逊实验室 下村 修 约翰逊实验室 Shimomura, O., Johnson, F.H. & Saiga, Y. J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223-239 (1962).

细胞内表达 Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。

颜色的改变与实用化 Roger Y Tsien (钱永健） Improved green fluorescence. Heim, R., Cubitt, A.B., &Tsien R.Y. Nature. 1995 Feb 23;373(6516):663-4. A monomeric red fluorescent protein. Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., Steinbach, P.A., Baird, G.S., Zacharias, D.A. & Tsien, R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7877-7882 (2002). 改进GFP 在 研究活细胞方面GFP的作用惊人，并且科学家们正在努力使它变的更得有用，他们正在改进GFP分子以使其发出不同颜色的荧光。科学家们目前可以制造蓝色荧 光蛋白，黄色荧光蛋白和大量其他颜色的荧光蛋白质。方法是使发色团产生能改变其稳定性的小的变异。数以万计不同的变形都被尝试过了，我们可以从PDB中找 出几个成功的例子。科学家们还利用GFP来发明生理传感器：一种感应离子或酸碱度水平，然后通过发出特征性的荧光来报告结果的分子机器。这里所展示的分子 （蛋白质编号1kys）是一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白，当红色的锌离子连接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍的荧光从而形成容易被检测到的可见信号。 第一个成功的GFP突变体  GFP的首个重大改变是钱永健在1995年完成。GFP的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的 GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。 Improved green fluorescence. Heim, R., Cubitt, A.B., &Tsien R.Y. Nature. 1995 Feb 23;373(6516):663-4. 第一个荧光探针  钱永健等发明了第一个基于荧光蛋白的遗传编码的钙离子探针。虽然它的应用不是很广泛，但它为后面大量的荧光探针的出现铺平了道路。 Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J.M., Adams, J.A., Ikura, M. & Tsien, R.Y. Nature 388, 882-887 (1997). 第一个不是绿色的荧光蛋白  DsRed荧光蛋白呈现红色。在所有的荧光蛋白都发绿光时，这个红色显得弥足珍贵，它使多色荧光标记成为可能。不过DsRed最大的缺陷是它的四聚体结构，这就限制了它在某些方面的应用，比如作为融合标签。 Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L. & Lukyanov S.A. Nat. Biotechnol. 17, 969-973 (1999). DsRed的成功改造  钱永健等实现了对DsRed的定向改造，除去了四聚化的必要条件，将它成功改造成单体形式，命名为mRFP1，因而大大改善了它的应用前景。 A monomeric red fluorescent protein. Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., Steinbach, P.A., Baird, G.S., Zacharias, D.A. & Tsien, R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7877-7882 (2002).

● GFP的发光原理 多管水母 中的 GFP是分子 量为27~30kD的单体蛋 白， 由238个氨基酸组成。GFP的发光基团是 由 Ser65、Tyr66和Gly67三个氨基酸经过环化和Tyr66 的氧化脱氢后形成的一个咪唑环图4[5]。其荧光发生与发光基团的周围环境有关，真正发光的是咪哇环上的酚阴离子。 。 图4 GFP的发光基团 [5] Dopf J,Horiagon T M. Gene, 1996: 173: 39-44

● GFP的发光原理 图 5　GFP在紫外线下的吸收峰和发射峰

● GFP的研究意义及基本应用 GFP作为报告分子具有巨大的潜力，主要是因为它具有以下特性： GFP 在 p H 7～12 范围内也能正常发光[6]；对高温(70 ℃) 、 碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶 Pronase 除外) 都有较强抗性。 ★检测方便。用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可进行活体观 察 ,不会损伤正在生长的细胞和组织[7]; ★无种属特异性 ,也没有细胞种类和位置的限制 , Chalfie M 等用 PCR 方法扩增 GFP cDNA后 ,克隆到原核表达载体上 , 转化大肠 埃希菌 , 经IPTG 诱导后 ,在紫外光照射下转化细菌能发出绿色荧 光; [6] Klait hem M Alkaabi , Abeer Y. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2005 ,126 (2) :149-156. [7] Marek H , Slavom R , Vladislav C. Plant Cell Tissue and Organ Culture , 2006 ,86 (3): 303-318.

● GFP的研究意义及基本应用 ★ GFP 对受体细胞基本无毒害。Sheen J等[8] 证实在玉米转 GFP 基 显毒害; ★不受假阳性干扰。由于其他生物本身不含有GFP ,因此不会出现假阳 性结果 , GFP 作为分子探针可以代替荧光染料避免由于染料扩散造成 的定位不准 ,使结果真实可靠; ★不需任何反应底物和辅助因子; ★可制成永久标本。GFP 的荧光可以耐受光漂白 ,也可耐受福尔马林的 固定 ,因而可制成长期保存的标本; ★灵敏度高。GFP 标记方法比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分 辨率。 [8] Chongmei D , Peter B , Kate V ,et al. Plant Cell Reports, 2006 ,25 (5): 457-465.

● GFP的研究意义及基本应用 在生物学上的应用 GFP可以作为标记分子 ,目前已被广泛应用于基因标记 、蛋白质标记、环境微生物研究、寄生虫学研究以及发育生物学研究中基因表达模式的探索等方面 ,成为活细胞分子水平研究的工具。 绿色荧光蛋白质不仅可以帮助科学家更好地了解细胞机制如何工作。而且，利用转基因技术，科学家可以让所有细胞和动物都可以产生荧光蛋白质。美国康涅狄格学院化学家，《发光基因》作者马克·齐默则将绿色荧光蛋白质称之为——21世纪的显微镜。

1997 大阪大学 ● GFP的研究意义及基本作用 图6 发光老鼠 图6中的小老鼠是1997年7月在大阪大学降生的，它们成为第一种能够在夜里发光的哺乳动物。研究人员可利用荧光老鼠研究胎儿发育等。老鼠之所以发光，是因为其体内转入了水母荧光蛋白基因。荧光基因，相当于一个跟踪标记信号，它转入到小鼠身上后，科研人员可清楚地看到它转到了哪里，在什么染色体上。这样，科研人员可判断基因转入的路径等，从而找到有效的基因转入方法。 图6 发光老鼠 1997 大阪大学

杰夫-利希曼(Jeff Lichtman）实验室 ● GFP的研究意义及基本作用 在第一次发现绿色荧光基因之后，一系列其它颜色的基因又相续浮出水面，这样，使得科学家能够一次性跟踪一种以上的蛋白质。美国哈佛大学杰夫-利希曼(Jeff Lichtman)等科学家利用多种颜色荧光蛋白基因转移绘制了大脑神经网络图，它展现了大脑内的脑神经网络的连接，图片中美丽的五彩缤纷的部分就是神经系统网络。 研究人员通过激活神经元中复合荧光蛋白，进行了前所未有的大脑和神经系统成像，获得了色彩斑斓的“大脑彩虹”图7，这有利于对大脑工作方式进行更深入研究。利用大脑彩虹，研究人员能用将近90种不用的研究标记神经元，这是目前荧光标记方法的一个巨大进步，而且个体明亮色彩的神经元的视觉分辨率得到了提升，这也对于描绘大脑环路和神经系统及其有利。 科学家通过特殊的基因工程手段，成功地对大脑神经元进行了多重着色。 这将使科学家能够建立大脑神经网络的详尽图表，有助于对大脑工作方式进行深入研究。研究中，科学家们利用特殊的基因工程手段，成功地让转基因小鼠神经元表达了4种颜色的荧光蛋白：黄色、红色、青色、橙色（或绿色）。结果在小鼠脑部细胞可以观察到大约90种不同的色彩，色彩斑斓，研究人员称其为“大脑彩虹（Brainbow）”。 图7 脑神经网络 杰夫-利希曼(Jeff Lichtman）实验室 美国哈佛大学

GFP的研究意义及基本应用 2007年底，韩国科学家通过改变控制猫科动物皮肤颜色的基因，克隆出一只能在夜晚发光的“荧光猫”。　韩国顺天大学的科学家们使用母猫的皮肤细胞，对其进行基因改造，通过使用病毒使这个细胞具有荧光蛋白基因，然后将其植入移除掉细胞核的卵细胞中，卵细胞随后又被植入代孕猫的子宫。这样，四只基因改造小猫就诞生了。遗憾的是，在对母猫进行剖腹产的时候，两只小猫不幸夭折。不过依然令人惊喜 图8 发红光的猫 的是，幸存的两只小猫生长良好，而它们的皮肤一旦暴露在紫外光下，就能发出红色光。 研究人员说这项技术可帮助人类遗传性疾病的治疗和珍惜动物的保护。这种技术可以应用于克隆那些与人类遭受同样疾病困扰的动物，也可以帮助开发干细胞治疗法。猫有250多种遗传疾病，这些疾病同时也会影响到人。科学家们认为，这一研究有助于治愈人类遗传性疾病，帮助珍惜动物的繁殖再生，比如濒临绝种的老虎。

在生态学上的应用 GFP在生态学中的应用将 GFP基因直接导入目标生物或将 GFP 基因克隆到病毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标生物 ，进行生态学规律研究。 水污染检测？

在生态学上的应用 朱应等构建了带 GFP基因的重组棉铃虫病毒。该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染 ,室内饲养 3代 ,各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫 , 表明病毒可以介导GFP标记其宿主 ,预计将为研究棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段。

荧光显微镜

共聚焦显微镜光路

物理构造

Jablonski Diagram Excitation：~10－15 s； Emission：~10－9 s； VR：10－12~10－14 s； IC：10－11~10－13 s； Lifetime of S2~Sn: 10－12~10－14 s；

Principle of FRET Non-radiative “spectroscopic ruler”

Instrumentation for FRET Cornish Peter V, et al. ACS Chemical Biology, 2007, 2, 53-61

Several approaches to FRET Shimon Weiss. SCIENCE, 1999, 283, 1676-1683

Protein Folding Dye pairs: fluorescein/rhodamine R0 = 45 ~ 50 Ǻ Hui-hua Li, et al. J Biol Chem. 2000. 275(47), 37048–37054

目录 原子结构与分析 外层电子跃迁与内层电子跃迁 青铜器鉴定中的分析技术 分子的成键电子跃迁 化学键的伸缩与摇摆—红外光谱 DNA的解析 细胞表达与检测

从原子核到生物分子 原子核和电子 原子 分子 生物活性分子

五光十色的世界 波谱/光 波长范围：1 A（0.1nm）- mm - m 对应能级：原子内层电子-原子间电子-振动转动-核自旋

光电磁辐射和波谱 微粒性 光子能量 E=h 转换成波长 E=hc/λ 光电效应： E=h–ω y=Asin(2t+)

波尔理论 没有辐射电磁能量时，原子体系处于稳定态 仅当原子体系从一个能态变至另一个能态时，才发生电磁辐射的吸收或发射 吸收或发射过程对应于具有辐射能 hν=ΔE的光子

从DC到X-射线的电磁波谱图 NMR 20-900MHz UV-VIS 2.5m-240nm 微波波谱 2000MHz-300GHz   微波MW 肉眼可见频率范围 超低频 LSF 低频 L 中频 MF 高频 HF 很高频 SUHF 紫外高频 UVF 特高频 VH 超高频 UVH 红外 IR 可见 VIS 紫外 UV X-射线 X-ray UV-VIS 2.5m-240nm 微波波谱 2000MHz-300GHz NMR 20-900MHz 700-400nm 0-15KHz平常人耳可听见的频率范围 核四极共振 2-1000MHz ESR X-带9.46GHz 1mm-2.5m 10-4000cm-1 Raman λ 3×104m 3×103m 300m 10m 0.67m 30cm 3cm 10-3m 700nm 300nm 3nm 0.03nm 10KHz 100KHz 1MHz 30MHz 450MHz 1GHz 10GHz 300GHz 4.3×1014Hz 1015Hz 1017Hz 1019Hz

与电磁辐射有关的光谱法 —— —— 1.3×104–3.3×104 光谱 波长 波数 量子转移类型 -线发射 0.005-1.4 Å 核   核 X-线吸收、发射、荧光、衍射 0.1-100 Å 真空紫外吸收 10-180nm 1×106 - 5×104 成键电子 紫外-可见吸收、发射、荧光 180-780nm 5×10–1.3×104 红外吸收与拉曼散射 0.78-300µm 1.3×104–3.3×104 微波吸收 0.75-3.75mm 13 – 27 分子转动 电子自旋共振 3cm 0.33 磁场中电子自旋 核磁共振 0.6-10m 1.7×10-2- 1×103 磁场中核自旋 —— —— 内层电子 分子振动、转动

原子的外层电子能级 O N M L K 电离限 Kα1 Kα2 L α2 L α1 L β L γ K β

分子的结构

胰岛素的三级结构

血红蛋白的结构 血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的α亚基和二个由146个氨基酸残基组成的β亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。

斑点的确认－电子显微镜 扫描 Ag， Si ， O 等元素分别

几种青铜器

青铜器的鉴定与考古 为什么先有青铜器？ 不同产地的青铜器合金成分不同 冶炼过程的考证方法

我国商周时代铁青铜古称“吉金”。其化学成分是锡、青铜和铅、锡，如铜与锡的合金为锡青铜，铜与铅的合金为铅青铜，其它还有铅、锡、青铜，镍青铜等；在青铜器的加工方法上，奴隶们创造了青铜衔接技术和冷加工技术。到春秋中后期，还兴起了在青铜表面嵌入红铜薄片的技术和嵌入金银丝的金银错工艺，这一切又都显示了奴隶们的才干和智慧。

凝固点降低 冰盐浴 汽车防冻剂 金属溶液

高温下的金属溶液 常温下可能存在地金属溶液？－－汞 铜的熔点？ 锡，铅的熔点？ 铜器的熔点？ 铜锡合金－－－－

高温生成的办法 碳火 冶炼过程中化学反应 器具的成型

合金分析的方法 化学分析 原子发射光谱

原子的外层电子能级 O N M L K 电离限 Kα1 Kα2 L α2 L α1 L β L γ K β

原子外层电子能级图谱 量子化的 可以获能跃迁 激发态返回基态时释放能量 应用 发射光谱 原子吸收光谱

原子发射光谱的基本原理

单道扫描式ICP 检测器 出射狭缝 入射狭缝 等离子体 光栅 Theory 13

光学系统结构图 光栅 棱镜 CCD检测器 6

ICP-OES Basic Concepts 单道扫描光谱仪 32

ICP-OES Basic Concepts 多道光谱仪 31

光电直读光谱仪

遥测原子光谱仪

登陆火星的海盗者1号 Viking Lander 1 to Mars

海盗者1号局部

海盗者1号说明 气相色谱－质谱仪 X射线荧光分析

X-ray原理 K β O N M L K 电离限 Kα1 Kα2 L α2 L α1 L β L γ

X－射线作用下 内层电子跃迁 外层电子填补空轨道 发出多余能量

能量色散2Rh阴极X-rays仪获得的铁样光谱

花岗岩样品的WDXRFA图

分子外层电子能级 分子能级图

成键电子的跃迁－UV-VIS光谱

化学键的振动与转动能级 IR

红外光谱的产生-吸收 IR区主要限于分子各振动和转动能态间的跃迁 分子必须有一个由振动或转动引起的偶极矩的净变化： 辐射频率与分子振动的自然频率相匹配； BACK

Types of Molecular Vibrations 分子振动类型 Stretching Vibrations 伸缩振动 “+” 面外弯折振动 “-”面内弯折振动 Bending Vibrations 弯曲振动

The Vibrations of CO2 Asymmetric stretch Symmetric stretch Bending

简 谐 振 动

双原子分子的核间距与位能

氯仿的红外光谱图

Infrared Absorption Spectrum of a Thin Polystyrene Film聚苯乙烯薄膜的红外吸收光谱 Note that the abscissa横坐标 scale changes at 2000 cm-1. Usually wavenumber is used: directly proportional to energy. 横坐标不是线性的，使用波数表示，直接正比于振动能量。

典型的红外光谱图

生物体系的红外分析－血清与血渍

皮肤切片的分析 A 临床分析 B－d 不同波长红外分析结果与成像

DNA测序 四种碱基 A G C T 腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶

碱基的选择性剪切 Dimethylsulfate at pH 8.0 -----------> G 分布反应条件控制 Dimethylsulfate at pH 8.0 -----------> G Piperidine formate at pH 2.0 -------> G and A Hydrazine ------------------------------> C and T Hydrazine in 1.5 M NaCl -----------> C 1.2 N NaOH at 90 oC -----------------> A and some C

Partial Reactions: 硫酸二甲酯 pH 8.0 5’*NNGACGTACTTA3’ 5’*NNGACGTACTTA3’

Partial Reactions: 硫酸二甲酯 pH 8.0 5’*NNGACGTACTTA3’ Modification of some, but not all, of the G bases as the reaction is not allowed to go to completion 5’*NNGACGTACTTA3’

Partial Reactions: 硫酸二甲酯 pH 8.0 未标记的部分检测不到 有G的地方出现放射性标记 5’*NNGAC3’ 5’*NN3’ 5’TACTTA3’ 5’ACGTACTTA3’

Partial Reactions: 阱体系反应 5’*NNGACGTACTTA3’ Some, but not all, C and T bases are modified as the reaction is not allowed to go to completion 5’*NNGACGTACTTA3’

Partial Reactions: 阱体系反应 Unlabeled fragments Labeled T C set 5’*NNGACGTAC3’ 5’*NNGA3’ 5’*NNGACGTACT3’ 5’*NNGACG3’ 5’*A3’ 5’GTACTTA3’ 5’*TA3’ 5’G3’ 5’ACTTA3’ 5’ACTTA3’

Chemical cleavage method Dimethyl sulphate piperidine formate hydrazine +1.5 M NaCl hydrazine

DNA碎片的分离 目前DNA分离可以实现不同长度单碱基分辨率的分离 聚丙烯酰胺凝胶基体

DNA变性 凝胶电泳主要是针对分子尺寸的分离 8M尿素就可以实现 8 M Urea 8 M Urea Self annealing DNA Double stranded DNA 8 M Urea Denatured Single Stranded DNA Denatured Single Stranded DNA 8 M Urea

Fragments cut at G

Read DNA sequence from electrophoresis-autogram

此方法不足之处 使用化学危险品 大量放射性标记 测序结果可能因胶性质变化 放射性自显影的限制 不易自动化

快速DNA测序技术 毛细管电泳 多通道毛细管电泳系统 人类基因组工程 蛋白质组 2D GEL MALDI TOF MS

Anal. Chem.2001, 73,1234-1239

光谱方法 其他一些应用

宏观红外光谱应用 尺度 10m分辨率，范围 数Km 红外遥感卫星 军事用途 民用 探矿、天气预报、农业产量估计 紧急事态监控 大兴安岭火灾

纳米材料的表征 分辨率 亚纳米级，范围200nm

分析设备的微型化自动化 分辨率亚米级 范围50米

多谢，请提问zxx@pku.edu.cn