Biochemistry and Molecular Biology 生物化学与分子生物学 Biochemistry and Molecular Biology 生物化学与分子生物学教研室 生物化学与分子生物学党支部

绪 论

生物化学就是生命的化学。它是研究活细胞和有机体中存在的各种化学分子及其所参与的化学反应的科学。 分子生物学：是研究生物大分子结构、功能及其调控机制的科学。

一、生物化学发展简史 二、生物化学研究内容 三、生物化学与医学 四、本课内容简介

生物化学研究内容 生物分子的结构与功能 物质代谢及其调节 遗传信息的传递及其调控

生物化学与医学 生物化学的理论与技术已渗透到医学科学的各个领域 生物化学与分子生物学在生命科学中占有重要的地位 生物化学的发展促进了疾病病因、诊断和治疗的研究

本课内容简介（一） 蛋白质的结构与功能 酶 生物氧化 糖代谢 脂类代谢 氨基酸代谢

本课内容简介（二） 核酸的结构与功能 核苷酸代谢　 基因信息的传递 细胞信息传递 癌基因、抑癌基因与生长因子 血液的生化

Structure and Function of Protein 第 一 章 蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein

蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。

蛋白质的生物学重要性 1. 蛋白质是生物体的重要组成成分 2. 蛋白质具有重要的生物学功能 3. 氧化供能 1）作为生物催化剂 　1）作为生物催化剂 　2）代谢调节作用 　3）免疫保护作用 　4）物质的转运和存储 　5）运动与支持作用 　6）参与细胞间信息传递 3. 氧化供能

蛋白质的分子组成 The Molecular Component of Protein 第 一 节 蛋白质的分子组成 The Molecular Component of Protein

 蛋白质的元素组成 主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量P或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还含有 I 。

 蛋白质元素组成的特点 通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式： 蛋白质的含氮量平均为16％。 蛋白质含量 ( g % ) = 含氮量( g % ) × 6.25

一、氨基酸 ——蛋白质的基本组成单位 存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L--氨基酸（甘氨酸除外）。

L-氨基酸的通式 R CH3 丙氨酸 H 甘氨酸

（一）氨基酸的分类 非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸

非极性疏水性氨基酸

2. 极性中性氨基酸

3. 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸

习惯分类方法 芳香族氨基酸：Trp、Tyr、Phe 含羟基氨基酸：Ser、Thr、Tyr 含硫氨基酸：Cys、Met 杂环族氨基酸：His 杂环族亚氨基酸：Pro 支链氨基酸：Val、Leu、Ile

几种特殊氨基酸 Gly：无手性碳原子。 Pro：为环状亚氨基酸。 Cys：可形成二硫键。

修饰氨基酸： 　　蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸（Hyl）。 非生蛋白氨基酸： 　　蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。

（二）氨基酸的理化性质 1. 两性解离及等电点 2. 紫外吸收 3. 茚三酮反应

二、肽 （一）肽(peptide) * 肽键(peptide bond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。

多肽链(polypeptide chain) 二肽，三肽…… 寡肽(oligopeptide)，多肽(polypeptide) 氨基酸残基(residue) 氨基末端（amino terminal）和羧基末端（carboxyl terminal） 主链和侧链

多肽链

多肽链

（二） 几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH) 结构:

谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽 谷氨酸的-羧基形成肽键 －SH为活性基团 为酸性肽 是体内重要的还原剂

主要功能: H2O2 2GSH NADP+ GSH过氧化物酶 GSH还原酶 2H2O GSSG NADPH+H+

2. 肽类激素及神经肽 肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH） 神经肽(neuropeptide)

三、蛋白质的分类 * 根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质 结合蛋白质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分 * 根据蛋白质形状 纤维状蛋白质 球状蛋白质

蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein 第 二 节 蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein

蛋白质的分子结构包括： 一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure) 高级结构

一、蛋白质的一级结构 定义： 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。 主要化学键：肽键 　　二硫键的位置属于一级结构研究范畴。

一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。 21 30 胰岛素的一级结构

二、蛋白质的二级结构 定义： 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。 稳定因素： 氢键

（一）肽单元 (peptide unit) 参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。

肽单元 H H H H

蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋 (  -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil )

（二） -螺旋 结构要点: ①多肽链主链围绕中心轴形成 右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。 ②每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。 ③每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。

（三）-折叠 ①多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。 ②两段以上的β -折叠结构平行排列 ，两链间可顺向平行，也可反向平行 。 ③两链间的肽键之间形成氢键，以稳固β -折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。

（四）-转角和无规卷曲 -转角： ① 肽链内形成180º回折。 ②含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。 ③ 第二个氨基酸残基常为Pro。 无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。

-转角：

（五）模体 蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体(motif)。

锌指 螺旋－环－螺旋

（六）影响二级结构形成的因素 影响α-螺旋形成的因素： 氨基酸侧链所带电荷 、大小及形状。 β -折叠形成条件： 　　要求氨基酸侧链较小。

三、蛋白质的三级结构 定义 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。 稳定因素： 疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。

肌红蛋白 (Mb) N 端 C端

结构域 (domain) 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。 纤连蛋白分子的结构域

结构域 Triose phosphate isomerase

分子伴侣 (chaperon) 作用： 通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质。 * 可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可使肽链正确折叠。 * 与错误聚集的肽段结合，诱导其正确折叠。 * 对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要的作用。

四、蛋白质的四级结构 每条具有完整三级结构的多肽链，称为亚基 (subunit)。 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。 亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。

血红蛋白（Hb）的四级结构

The Relation of Structure and Function of Protein 第 三 节 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein

一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）一级结构是空间构象的基础 牛核糖核酸酶的一级结构 二硫键

天然状态，有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇 尿素、β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性

（二）一级结构与功能的关系 例：镰刀形红细胞贫血 HbA β 肽 链 HbS β 肽链 N-Val · His · Leu · Thr · Pro · Glu · Glu · · · · ·C(146) HbS β 肽链 HbA β 肽 链 N-Val · His · Leu · Thr · Pro · Val · Glu · · · · ·C(146)

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。

二、蛋白质空间结构与功能的关系 （一）肌红蛋白与血红蛋白的结构

（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。

肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线

* 协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 促进作用称为正协同效应 (positive cooperativity) 抑制作用称为负协同效应 (negative cooperativity)

变构效应(allosteric effect) 凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应。

（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。

蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。

疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。 PrPc α-螺旋 PrPsc β-折叠 正常 疯牛病

第四节 蛋白质的理化性质与分离纯化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein

一、理化性质 （一）蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 　　当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 　　利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。

（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜

溶液中蛋白质的聚沉 水化膜 － + + － 带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质 酸 碱 酸 碱 脱水作用 带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 溶液中蛋白质的聚沉

（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性(denaturation) 　　在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。

变性的本质： —— 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。 造成变性的因素： 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。

蛋白质变性后的性质改变： 　　溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。 应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

复性(renaturation) 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。

天然状态，有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇 尿素、β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性

* 蛋白质沉淀 　　在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 　　蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

（四）蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。

（五）蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。

二、蛋白质的分离和纯化 （一）透析及超滤法 * 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 * 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

*免疫沉淀法： 　　　将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

（三）电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。

（四）层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。

蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。

（五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。

三、多肽链中氨基酸序列分析 （一）改进的Sanger法 1. 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 2. 测定多肽链的N端与C端的氨基酸残基 3. 把肽链水解成片段，分别进行分析 4. 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 5. 经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。

水解肽链的方法及特征 裂解剂 裂解位点 胰蛋白酶 Lys、Arg（C） 胰凝乳蛋白酶 Phe、Tyr、Trp（C） 弹性蛋白酶 Ala、Gly、Ser、Val（C） 胃蛋白酶 Phe、Trp、Tyr（N） 溴化氰 Met（C） 羟胺 Asn—Gly

通过核酸推演的方法 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列