生物化学 Biochemistry 生物化学与分子生物学教研室 吴耀生 教授

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1 生物化学 Biochemistry 生物化学与分子生物学教研室 wuyaosheng03@sina.com 吴耀生 教授
, 吴耀生 教授

2 血糖 健康所系,性命相托 胰岛素 胰岛素原 胰岛素C肽

3 What help could you give to the patient?
What is the mechanism? How to diagnose? What help could you give to the patient? Mediterranean Anemia child

4 血红蛋白病（hemoglobinopathy）
据估计，全世界有一亿多人携带血红蛋白病的基因 据10年来在28个省市自治区近100万人口普查资料发现 2005年一篇临床研究报告表明,广西南宁市alpha地贫检出率为14.3%;广西南宁市郊为16.6%; 广东省妇保院为9.3%;广东珠海为7.3%;广东海南黎族alpha-, beta-地贫基因携带率分别高达50%,11.2% Hb病类型 发生率 发生地 基因携带率 异常Hb病 0.33％ 广西 13%± α地贫 2.64％ 广东 11%± β地贫 0.66％ 4

5 How to evaluate the outcome for your study (Our plan in this term )
Integrated assessment（综合评价): exams for each part, attendance for the classes, discussion, demonstration report, final examination, etc. Assessed contents（评价内容） The ratio at the final integrated marks Attendance for the class（上课） 5% demonstration report（实验报告等） 15% Middle-term exam （段考） 20% Final examination （期考） 60% 5

6 生物大分子结构与功能 物质代谢及其调节 基因信息的传递 专题篇
6

7 Questions 1．下列哪种物质不是人体的组成成分之一： A．糖原 B．水 C．无机盐 D．生物碱 E．核酸
2．人体中含量最丰富的有机物质是： A．脂肪 B．蛋白聚糖 C．蛋白质 D．核酸 E．胆固醇 7

8 Structure and Function of Protein
第一章 蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein

9 1. What are proteins 2. The importance of proteins in biology
3. The functions of Proteins 9

10 Main contents 1. Amino Acids and Linkage in Proteins
2. Molecular Structure of Proteins 3. Structure-Function Relationships of Protein 4. Physicochemical Properties of Proteins 5. Isolation and Purification of Proteins Disease cases Concepts Questions 10

11 Key points Difficult points
Classification of Amino Acids, characters Molecular Structure of Proteins: levels, characters, stable forces Insulin, bovine pancreas ribonuclease, Mb, Hb Physicochemical Properties of Proteins Difficult points Motif, domain, allosteric regulation 11

12 蛋白质研究的历史 十九世纪 二十世纪 二十一世纪 麦芽 淀粉酶； 胃液 胃蛋白酶; Hb 证明 Pr----氨基酸组成； 合成 多种短肽；
合成 多种短肽； 二十世纪 Pr----二级结构；Insulin----测序 Hb----四级结构 蛋白质研究的历史 1833年，从麦芽中分离淀粉酶；随后从胃液中分离到类似胃蛋白酶的物质。 1864年，血红蛋白被分离并结晶。 19世纪末，证明蛋白质由氨基酸组成，并合成了多种短肽。 20世纪初，发现蛋白质的二级结构；完成胰岛素一级结构测定。 20世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，促进了蛋白质研究迅速发展； 1962年，确定了血红蛋白的四级结构。 20世纪90年代，功能基因组与蛋白质组研究展开。 二十一世纪 Function Genomics,Proteomics 12

13 The Molecular components of Protein
第一节 蛋白质的分子组成 The Molecular components of Protein

14 主要有C、H、O、N和 S。 有些Pr含有少量P或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别Pr还含有I 。
组成蛋白质(Protein, Pr)的元素 主要有C、H、O、N和 S。 有些Pr含有少量P或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别Pr还含有I 。 14

15 Pr元素组成的特点 各种Pr的含氮量很接近，平均为16％。 生物体的含氮物质以Pr为主 生物样品中Pr的大致含量计算：
100克样品中Pr的含量 (g %) = 每克样品含氮克数× 6.25×100 1/16% 15

16 一、组成人体Pr的20种AA均属于L--AA
存在自然界中的AA(amino acid)有300余种，但组成人体Pr的AA仅有20种，且均属 L-amino acid（Gly除外）。 16

17 17

18 - C O O L-氨基酸的通式 R CH3 丙氨酸 H 甘氨酸 + C N H 3 H 18

19 二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类
非极性脂肪族氨基酸 极性中性氨基酸 芳香族氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸 19

20 (一)侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸
20

21 (二)侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸
21

22 (三)侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸
22

23 (四)侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸
23

24 (五)侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸
24

25 氨基酸分类归纳： 碱性赖精组，酸性天和谷 含硫半甲硫，羟基酪苏丝 芳香苯色酪，分支缬亮异 25

26 几种特殊氨基酸 脯氨酸 （亚氨基酸） CH 2 CHCOO - NH + 26

27 + OOC CH SH NH HS - CH COO NH OOC CH S NH COO -HH  半胱氨酸 胱氨酸 二硫键 - - 2
3 HS - CH 2 COO + NH 3 -HH 二硫键 - OOC CH 2 S + NH 3 COO 胱氨酸 27

28 修饰氨基酸，非编码氨基酸 Hydroxyproline（羟脯氨酸） Hydroxylysine（羟赖氨酸） Selenium, Se
Sulfur, S 28

29 鸟氨酸 瓜氨酸 不存在于蛋白质结构中的氨基酸 29

30 Questions 1．下列关于氨基酸的叙述，错误的是： A．Leu和Val是直链氨基酸 B．Tyr和Ser含羟基 C．Tyr和Phe含苯环
D．Lys和Arg是碱性氨基酸 E．Cys和Met均含硫 2．均含有疏水侧链的氨基酸有： A．Trp、Arg B．Arg、Leu C．Asp、Ala D．Phe、Ile E．Glu、Met 30

31 三、20种氨基酸具有共同或特异的理化性质 （一）氨基酸具有两性解离的性质 两性解离及等电点
等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。 31

32 +OH- +OH- +H+ +H+ pH>pI pH<pI pH=pI 阳离子 氨基酸的兼性离子 阴离子 32

33 Proteins (Trp, Tyr) 意义? （二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质 Trp、Tyr的最大吸收峰在 280 nm 附近。
芳香族氨基酸的紫外吸收 33

34 （三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物
氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。 意义? 34

35 四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链
（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽 (peptide) 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。 35

36 + -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键 36

37 肽 二肽，三肽…… 寡肽(oligopeptide) 多肽(polypeptide) 氨基酸残基(residue) 37

38 多肽链(Polypeptide chain)
38

39 N末端 C末端 牛核糖核酸酶 39

40 （二）体内存在多种重要的生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH) 40

41 GSH的功能? GSH与GSSG间的转换 H2O2 2GSH NADP+ 2H2O GSSG NADPH+H+ GSH过氧化物酶
41

42 2.多肽类激素及神经肽 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽(neuropeptide) 42

43 The Molecular Structure of Protein
第二节 蛋白质的分子结构 The Molecular Structure of Protein

44 蛋白质的分子结构包括: 高级结构 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure)
三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 高级结构 44

45 Green Fluorescent Protein, GFP
45

46 一、蛋白质的一级结构(Primary structure of Pr)
定义: 蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。 主要的化学键: 肽键(peptide bond)，有些Pr还包括二硫键。 46

47 一级结构是蛋质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。
47

48 二、蛋白质二级结构(Secondary structure of Pr)
蛋白质分子中某一段肽链的局部主链空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。 定义: 主要的化学键：氢键(hydrogen bond) 48

49 （一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上 参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。 49

50 50

51 （二）α-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构
-螺旋 ( -helix) -折叠 (-pleated sheet) -转角 (-turn) 无规卷曲 (random coil) 51

52 -螺旋(-helix) 52

53 R-group R-group R-group R-group R-group R-group R-group R-group
53

54 影响α—螺旋形成的主要因素 （1）同电相斥 （2）空间位阻 （3）Pro 出现转角 54

55 （三）-折叠(-pleated sheet )
55

56 -pleated sheet Antiparallel 56

57 -pleated sheet 57

58 （四）-转角(-turn )和无规卷曲(random coil)
无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。 58

59 （五）模体(motif)是具有特殊功能的超二级结构
在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构。 二级结构组合形式有3种：αα，βαβ，ββ 。 59

60 二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体(motif) 。
模体是具有特殊功能的超二级结构。 60

61 模体(motif)常见的形式 α-螺旋-β转角（或环）-α-螺旋模体 链-β转角-链模体 链-β转角-α-螺旋-β转角-链模体
钙结合蛋白中结合钙离子的模体 锌指结构 61

62 （六）AA残基的侧链对二级结构形成的影响
Pr二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其AA残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。 62

63 三、蛋白质三级结构(tertiary structure of Pr)
（一）三级结构是指整条肽链中全部AA残基的相对空间位置 定义: 整条肽链中全部AA残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。 疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。 主要的化学键: 63

64 64

65 肌红蛋白 (Mb) N 端 C端 65

66 （二）结构域是三级结构层次上的局部折叠区
分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密的区域，并各行其功能，称为结构域 (domain) 。 纤连蛋白分子的结构域 纤连蛋白是高分子量糖蛋白，含糖4.5%－9.5%，其亚单位相对分子质量为22万－25万。各亚单位在C端形成二硫键交联。血浆纤连蛋白是二聚体，由两条相似的A链及B链组成，整个分子呈V形。细胞纤连蛋白是多聚体。 主要功能是介导细胞粘着。纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白亦是重要的。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位 66

67 （三）分子伴侣参与Pr折叠 分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速Pr折叠成天然构象或形成四级结构。
分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。 分子伴侣在Pr分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。 67

68 伴侣蛋白在Pr折叠中的作用 68

69 四、蛋白质的四级结构(quaternary structure of Pr
有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。 亚基之间的结合主要是氢键和离子键。 69

70 由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。
Hb(4 subunits) 70

71 五、蛋白质的分类 根据蛋白质组成成分: 单纯蛋白质 结合蛋白质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分 根据蛋白质形状: 纤维状蛋白质 球状蛋白质
71

72 六、蛋白质组学 （一）蛋白质组学基本概念 蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质”。 72

73 （二）蛋白质组学研究技术平台 （三）蛋白质组学研究的科学意义 蛋白质组学是高通量，高效率的研究: 双向电泳分离样品蛋白质
蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析 （三）蛋白质组学研究的科学意义 73

74 The Relation of Structure and Function of Protein
第三节 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein

75 一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础
（一）一级结构是空间构象的基础 牛核糖核酸酶的一级结构 二硫键 75

76 天然状态，有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇 尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性 76

77 （二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能
胰岛素 氨基酸残基序号 A5 A6 A10 B30 人 Thr Ser Ile 猪 Ala 狗 兔 Gly 牛 Val 羊 马 77

78 （三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息 一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。 78

79 （四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病
例：镰刀形红细胞贫血 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · ·C(146) HbS β 肽链 HbA β 肽 链 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · ·C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。 79

80 80

81 81

82 二、蛋白质的功能依赖特定空间结构 （一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似 肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基 血红素结构 82

83 Similar structure between Hb subunit and Mb
83

84 ? 肌红蛋白(myoglobin，Mb) 肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段α-螺旋结构。 血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。
Peptide-(AA+)2 Fe2+-Heme-(CH2-CH2-COO-)2 His-F8-Peptide 84

85 Hb=α2β2→四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。
血红蛋白(hemoglobin，Hb) Hb=α2β2→四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。 Hb亚基之间的联系：8对盐键 85

86 （二）Hb亚基构象变化可影响亚基与氧结合
Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。 86

87 肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线
87

88 协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity) 88

89 89

90 血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。
O2 90

91 变构效应(allosteric effect)
蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。 91

92 （三）蛋白质构象改变可引起疾病 蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。 92

93 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。
蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。 93

94 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。
疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。 PrPc α-螺旋 PrPsc β-折叠 正常 疯牛病 94

95 The Physical and Chemical Characters of Protein
第四节 蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Protein

96 一、蛋白质具有两性电离的性质 蛋白质分子具有可解离的基团： 两端的氨基和羧基 氨基酸残基侧链中某些基团
Pr的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 96

97 二、蛋白质具有胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。
蛋白质胶体稳定的因素: 颗粒表面电荷 水化膜 97

98 溶液中蛋白质的聚沉 水化膜 + － + － － － － － － － － 带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质 酸 碱 酸 碱
脱水作用 + 带正电荷的蛋白质 － － － 酸 碱 不稳定的蛋白质颗粒 － － － － － 带负电荷的蛋白质 溶液中蛋白质的聚沉 98

99 三、蛋白质空间结构破坏而引起变性 蛋白质的变性(denaturation)
在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。 99

100 ——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。
变性的本质: ——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。 造成变性的因素: 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 100

101 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。
应用举例: 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 101

102 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。
102

103 天然状态，有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇 尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性 103

104 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。
蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 104

105 四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 105

106 五、应用蛋白质呈色反应测定蛋白质含量 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。
双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 106

107 The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein
第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析 The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein

108 利用蛋白质的各种理化性质建立分离纯化及分析方法
哪些性质可被利用？ 108

109 一、透析及超滤法可去除Pr溶液中的小分子
透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 109

110 Separation of molecules on the basis of size by dialysis
(a) Starting point (b) At equilibrium point Separation of molecules on the basis of size by dialysis 110

111 二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法
使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 111

112 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。
112

113 三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 113

114 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。
几种重要的蛋白质电泳: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 114

115 四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离
层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。 115

116 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。
蛋白质分离常用的层析方法 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 116

117 88 117

118 83 118

119 五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离
超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 119

120 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。
120

121 六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 121

122 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 122

123 七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定
二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。 123

124 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 124

125 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：
同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。 折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。 从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。 125

126 Disease sample Mediterranean Anemia Sicklemia Mad cow disease, MCD
G-6-PD deficiency, Favism 蚕豆病 126

127 127

128 128

129 Explain the concepts of following:
1 Acidic AA，basic AA ，aromatic AA 2 Peptide bond，Amide bond 3 Peptide plane，Main chain 4 Secondary structure，Tertiary structure， Quaternary strucutre 5 Isoelectric point, pI，Amphoteric dissociation 6 Protein denaturation，Salt out 7 Domain，Motif 8 Allosteric effect，Cooperative effect 9 Molecular disease 129

130 Any questions? 130

131 Questions 1．在pH6.0的缓冲液中电泳，哪种氨基酸基本不动? A．精氨酸 B．丙氨酸 C．谷氨酸 D．天冬氨酸 E．赖氨酸
3．天然蛋白质中不存在的氨基酸是： A．半胱氨酸 D．脯氨酸 C．丝氨酸 D．瓜氨酸 E．蛋氨酸 131