第八讲 生殖发育毒性及其试验与评价方法 1

第一节 概　述 哺乳动物的生育繁殖过程 外源化学物对生殖发育的影响 外源化学物对生殖发育损害作用的特点

哺乳动物的生育繁殖过程 生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包含生殖细胞发生（即精子发生和卵细胞发生）、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程。 生殖发育也可称繁殖过程。

连续、完整的生殖发育过程的六个阶段 A.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发 育与成熟、交配行为、受精。 B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、 着床。 C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、肧体发育、主 要器官形成。 D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发 育与生长、器官的发育与生长。 E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活 的适应性、断乳前的发育与生长。 F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生活的 适应、达到完全的性功能。

外源化学物对生殖发育的影响 干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。 可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。 神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程 。

外源化学物对生殖发育损害作用的特点 生殖发育过程较机体其他系统更为敏感； 外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广 泛和深远。不仅直接涉及雌雄两性个体，同时 还对其第二代甚至以后世代的个体产生影响。

第二节 生殖毒性及其评价 生殖毒性的表现 生殖毒性的评价方法

1950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄 体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形 。 1956年用于治疗妊娠反应的反应停，1961年后出现近 万例短肢畸形儿(海豹畸形)。 二恶英(TCDD)造成的大面积污染及其与人群生殖危害 的关系至今仍不清楚 。 过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生， 在世界范围内提高了人们对用药的安全意识，高度关注 新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响， 促进了与生殖内分泌系统安全相关法律的产生和研究方 法指南的问世。

一、生殖毒性表现 外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少。

对雄性生殖系统的毒作用 直接损伤睾丸中的细胞群 继发性的影响精子发生 对精子发生的有害作用 改变下丘脑-垂体功能 直接影响睾丸细胞功能 精子生成障碍 性欲异常，丧失生育能力 引起生殖细胞突变，造成可遗传损害

对雌性生殖系统的毒作用 对卵巢的损害：卵母细胞数下降/突变； 生殖道的损害：影响运送卵子/受精/受精卵发育 生长卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降； 干扰卵巢内分泌，影响受精/着床/胚胎发育 生殖道的损害：影响运送卵子/受精/受精卵发育 对下丘脑-垂体系统的损害：闭经，受孕力降低。

二、生殖毒性的评价 是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。 评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。

三段生殖毒性试验 主要是根据发育阶段的区别来设计的，每一段试验大致相当于上述两个阶段。 Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验） 主要反映妊娠前及妊娠初期的情况 Ⅱ段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验） Ⅲ段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验） 反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、 哺乳期的影响。

Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验 （一般生殖毒性试验） 目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚 胎着床的影响（前述生殖周期的A和B阶段）。 给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配成功；雌性交配前2周开始染毒（以覆盖3～4个动情周期），至妊娠第6天受精卵着床。

一般生殖毒性试验方法原则 受试动物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔 剂量分组：一般设立三个剂量组和两个对照组 高剂量组产生轻微毒性症状，但其死亡率不大于10%，也不能完全丧失生育能力。相当于1/10LD50。 低剂量组则不应产生任何可观察到的损害效应。相当于高剂量组的1/30。 中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。 如果1000mg/kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，则可不进行其他剂量实验。

染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径。 交配前雄性动物应染毒4-10周，雌性动物2周 一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法。 动物:至少采用一种动物，推荐用大鼠；每组雌雄各20只； 雌性动物妊娠13-15天处死，雄性交配成功处死。

评价方法 1. 雄性生殖毒性评价（动物试验） 精子生成分析（精子计数、形态学及其活率） 精子功能检测 睾丸标志酶活性检测 交配实验 显性致死试验

2. 雌性生殖毒性评价 三代两窝 F０ F３b F３a F１b F２b F２a F１a （断奶或出生8 周） 第一次交配 给予受试物 8 到12 周 第一次交配 第二次交配 观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况 21天断乳后给予受试物8到12周 21天断乳后给予受试物8 到12 周

两代一窝(和一代一窝)生殖试验 出生第８周给予受试物（F０） 第１６-１９周 雌雄交配 F１（每窝选留幼仔８只，雌雄各半） 断奶，给予受试物 第１６-１９周　雌雄交配 出生第８周给予受试物（F０）

观察指标： 受孕率: 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况 受孕率＝妊娠雌性动物数／交配雌性动物数×100％ 正常分娩率: 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响 幼子出生存活率＝正常分娩雌性动物数／妊娠动物数×100％ 幼仔出生存活率: 反映雌性动物分娩过程是否正常 幼子出生存活率＝出生后4天存活幼子数／分娩时出生幼子数×100％ 幼仔哺育成活率: 反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力 幼子哺乳成活率＝21天断乳幼子存活数／出生后4天幼子存活数×100％ 除上述４个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸形存，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考

Ⅱ段：胚体-胎体毒性试验（致畸试验） 生殖是对亲代动物而言，从配子生成、受精到胎体分娩是一生殖过程。 发育主要是对子代而言，从受精卵到性成熟的青 春期甚至一直到衰老都属于发育过程。发育毒性也称 为胚胎毒性。

基本概念 1.发育毒性(developmental toxicity) 指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的 在子代到达成体之前出现的有害作用，也称为胚胎毒性。具 体表现可分为: 生长迟缓: 即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下， 较正常的发育过程缓慢。 畸形: 由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种 器官表现形态结构异常。 功能不全: 即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动 及行为的缺陷或异常。 胚胎死亡: 某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎 或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。

2. 畸形、畸胎和致畸物 畸形:器官形态的异常。 致畸物或致畸原:凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。 畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。 致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。 3. 胚胎毒性作用 外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用，对母体无显著的毒效应。

4. 母体毒性作用 母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。 母体毒性作用与致畸作用关系 具有致畸作用，但无母体毒性出现。 出现致畸作用的同时也表现母体毒性。 不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。 仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。 在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。

5. 畸形与变异 在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。 机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。

致畸作用的毒理学特点 器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感 剂量与效应关系较为复杂 剂量效应关系复杂的表现及原因：在一定范围内，畸胎率与剂量成正比，当高到一定水平引起胚胎死亡而掩盖了致畸作用，畸胎率反而会下降。 致畸作用的剂量效应曲线较为陡峭，斜率很大。 致畸带：从无作用剂量到胚胎死亡剂量的范围

致畸作用的毒理学特点 种属差异以及个体差异在致畸作用中较为明显 在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。 种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。

致畸作用机理 Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括 突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功 能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、 渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有 很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影 响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤 在损伤和修复之间的平衡。

Wilson发育毒理学基本原理 （一）对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境 因子相互作用的方式。 （二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不 同而变化。 （三）致畸物以特异的方式（作用机制）作用于发育的细胞 和组织，启动一系列的异常发育事件（细胞病理机制）。 （四）有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身 的性质。 （五）异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功 能缺陷。 （六）随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之 增加，从无毒作用到全部致死。

致畸作用机制 基因突变引起胚胎发育异常 细胞死亡和增致速度减慢 细胞间通讯抑制 胚胎中间代谢障碍 胚胎组织发育过程的不协调

外源化学物发育毒性的评价 传统常规致畸试验 主要试验方案：由美国环境保护局（EPA）首先提出。 1. 三段生殖毒性试验主要用于评价药物的生殖发育毒性。 2. 一代和多代生殖毒性试验主要用于评价食品添加剂、农药 及其他化学物的生殖发育毒性。 3. 改进的大鼠发育神经毒性的试验程序。

动物选择: 致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物 的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近， 体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注 意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与 人类接近等特点。 通常采用两种动物：一种啮齿类，首选大鼠；另一 种非啮齿类推荐家兔。

剂量分组： 一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组为无母体和胚胎毒性反应；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。 一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂量可为 1／100～1／30。

给药期： 在胚胎器官形成期连续给药（由胚胎着床到硬腭闭 合），大鼠孕后6～15天，家兔6～18天。 由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物 接触受试物的时间，必须在器官发生期。

动物交配处理： 每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等 大动物3～4只。 将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。 每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现 阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。

胎仔检查： 自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后约第20天，小鼠第19天，家兔在第29天。

活胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚期死亡胚胎的鉴别方法： （1）活胎：胚胎已完整成形，色鲜红，有自然运动，机械刺激后有运动反应。 （2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色泽可因死亡时间的相对迟早及死后自溶时间的长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胚胎形体较小，外形不完整，各部位发育尚未完全，呈紫红色，无自然动作。

早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明显 胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动，机 械刺激后亦无运动反应。

下列几方面进行畸形检查： 外观畸形肉眼检查，例如露脑； 肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂； 骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。

结果评定： 活产幼仔平均畸形出现数: 即根据出现的畸形总数，计 算每个活产幼仔出现的畸形平均数。活产幼仔平均畸形 出现数＝畸形总数／活产幼子总数 畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占 的百分率。 畸胎出现率＝出现畸形的胎仔总数／活产胎 仔总数 母体畸胎出现率: 即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总 数中所占的百分率。母体畸胎出现率＝出现畸胎的母体 数／妊娠母体数

致畸指数=母体LD50/最小致畸剂量 致畸危险指数=最大不致畸剂量/最大可能摄入量 致畸指数可用于判定致畸作用带的宽窄和致畸性的强弱。 致畸指数小于10者一般不致畸，10～100者为致畸，大于 100者为强致畸。 对于有害物质在食品中存在时人体受害几率，可计算致 畸危害指数。指数大于300,对人危害小；100～300对人 危害中等；小于100对人危害大。 母体毒性／发育毒性（对母体最低损害作用剂量A／胎仔 最低损害作用剂量D）：比值越大，危险性越高。A／ D≥3,具有发育毒性危险性；A／D<3，相对危险较低或不 具危险性。

化学物致畸能力分类 基准 A类 B类 C类 D类 1.最小母体中毒剂量与最小致畸剂量之比值 远大于1 大于1或两剂量间有很大重叠 小于1 母体中毒时无致畸 2.畸胎率 高， 与剂量有关 低， 但与剂量有关 - 3.较低剂量的致畸种类 有特定的 器官系统 一般为多发性，也可能有某些特点 无特异性， 广泛多发 4.靶细胞 特定细胞 泛化， 非特定细胞 不详 5.安全系数范围 ～400 ～300 ～250 ～100

确定受试物是否具有致畸作用时需注意以下几点： 任何结果必须通过统计计算方法进行剂量组与对照组对比；必须具有统计学意义才能认为是阳性结果。 应该掌握所用实验动物品系的自然畸形发生率。 致畸作用中动物物种和品系差异较为显著，因此要求在两种动物进行试验。由于物种差异，对动物不具有致畸作用的外源化学物对人是否致畸的问题，应格外认真对待。

发育毒性的替代试验 大鼠全胚胎培养 胚胎细胞微团培养 小鼠胚胎干细胞试验 发育毒性的体内预筛试验(C .K.试验)

Ⅲ段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验） 目的：评价母体从着床至断乳期间接触受试物对妊娠/哺乳 母体和对胎仔及仔代直至性成熟的有害效应。 受试动物：多用大鼠，也可用小鼠或家兔 给药期：雌性动物给药期应从胚胎硬腭闭合至哺乳结束，通 常大小鼠为妊娠第15天开始至分娩28天和21天，家兔于妊娠 第22天至分娩后31天。 动物处理：雌性动物分娩并饲养其子代至离乳，每窝选择雌、 雄子代各1只，饲养至成年，然后进行交配检测其生殖能力。

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