基础医学研究技术___ 分子生物学实验技术 武汉大学基础医学院生化与分子生物学系 喻红 Tel : 68759795(O)

分子生物学研究 分子生物学研究对象 分子生物学研究技术 实验内容： 核酸的分离纯化、鉴定与分析 基因工程技术基本流程

Contents 核酸的分离制备及分析 1 基因工程基本流程 2 分子生物学实验常用仪器介绍 3

2011级硕士生分子生物学实验 核酸的分离制备及分析及在医学研究中的应用 基因工程技术基本实验 DNA的制备与分析 真核细胞基因组DNA的分离纯化(蛋白酶K法) DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定 基因表达水平分析的原理与方法（RNA的分离纯化及分析） 真核组织总RNA提取（TRIzol试剂法） RNA紫外定性、定量分析及甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 目的基因PCR及PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 凝胶成像系统的应用（示教） 基因工程技术基本实验 利用感受态细菌（DH5a）进行重组质粒转化、Amp琼脂平板筛选 利用阳性克隆菌（单菌落）进行质粒的小量扩增 质粒DNA提取（碱裂解法） 质粒DNA的限制性内切酶酶切及酶切片段非变性 PAGE鉴定

2011级硕士研究生分子生物学实验课程表 I．核酸的分离纯化、鉴定与分析 II．基因工程基本原理、流程及应用 9.9 9.169.23 日期 2011.9 授 课 内 容 9.9 9.169.23 I．核酸的分离纯化、鉴定与分析 及在医学研究中的应用 A．DNA的制备与分析 介绍DNA分离纯化的原则、分析鉴定方法及研究新进展 真核细胞基因组DNA的分离纯化(蛋白酶K法) DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定 II．基因工程基本原理、流程及应用 A．感受态细胞制备、质粒转化、阳性克隆扩增 概述基因工程基本流程 利用感受态细菌进行质粒转化、平板筛选 利用阳性克隆菌进行质粒的小量扩增 9.10 9.17 9.24 B．基因表达水平分析的原理与方法 （RNA的分离纯化及分析） 介绍RNA分离纯化的原则、要点、条件、分析方法及新进展 TRIzol试剂提取真核组织总RNA RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 介绍PCR技术的原理及应用 采用提纯的质粒DNA进行目的基因PCR B．质粒DNA的提取、鉴定分析 1．介绍质粒在基因工程中的应用 2．质粒DNA的碱裂解法提取 9.11 9.18 9.25 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 凝胶成像系统的应用（示教）； 质粒DNA的限制性内切酶酶切分析； DNA小片段的非变性PAGE 考 试

核酸的分离与纯化 基本原则： 1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研 究核酸结构和功能的基础； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。

真核核酸提取的主要步骤 来源：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞） 温和裂解细胞，溶解核酸，使核酸与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。

核酸分离提取的主要步骤 核酸的浓缩和沉淀 核酸的贮存 核酸的纯化 细胞的破碎： 物理方法 溶胀和自溶 化学方法 生物酶降解 Step 1

蛋白酶K－苯酚抽提法分离纯化真核细胞基因组DNA DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定

蛋白酶K－苯酚抽提法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤。可从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。常采用EDTA、SDS以及蛋白酶K等试剂作用下破膜、消化细胞，并使组织蛋白与DNA分子分离，再用酚、氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀而获得高纯DNA。操作中常加入RNase除去RNA，这一方法获得的DNA可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、基因组DNA文库构建等实验。通常可得到100～200kb的DNA片段。（一般真核细胞基因组DNA有107-9bp。） DNA提取应注意 （1）防止和抑制DNase对DNA的降解； （2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

操作步骤 1．材料处理 新鲜或冰冻组织处理： ⑴ 取约50～100mg肝组织, 剪碎，加组织细胞裂解液0.5ml匀浆。 ⑵ 将匀浆液转至1.5ml Eppendorf管（Ep管）中。(此时于匀 浆液中加入终浓度为20μg/ml的无DNase的RNase A)。 ⑶ 加5μl蛋白酶K (终浓度100μg/ml)，混匀。 ⑷ 37℃水浴1h后转为50℃水浴3h（裂解细胞，消化蛋白）， 经常摇动。

操作步骤 2．室温下加500μl饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀10min。 3．离心12000rpm×10min,取上层水相到新Ep管中 (约450μl)。 4．加等体积氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀，离心12000rpm×10min，取上层水相(约300μl)到另一Ep管中。 5．加1/10体积的3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀。 6．离心14000rpm×15min，小心弃上清液。 7．沉淀用70%冷乙醇洗涤1-2次，离心收集沉淀DNA,室温下挥发乙醇(勿使DNA完全干燥)。 8．沉淀DNA加50-100μl TE缓冲液溶解，－20℃保存或直接分析.

注意事项 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。 弃去乙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。 37%以上浓度的异丙醇或者70%以上浓度的乙醇可选择性沉淀DNA，一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 室温下放置16h或65℃放置1h，可加快基因组DNA沉淀的溶解。

核酸的鉴定与分析 紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。 核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。 多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。 DNA测序 基因表达分析:（RNA详细结构和数量的分析）

DNA的鉴定 原理 一、紫外法测DNA的纯度及浓度 组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50μg/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。

操 作 取15μlDNA样品溶于双蒸水至3ml，分别于260、280、230nm 处比色并记录。 定量分析： 操 作 取15μlDNA样品溶于双蒸水至3ml，分别于260、280、230nm 处比色并记录。 定量分析： DNA＝A260×核酸稀释倍数×50/1000 纯度分析： DNA A260/A280=1.8 A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。 注：此法不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。

核酸凝胶电泳－核酸的分级分离 核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的标准方法。

影响核酸电泳的因素 1 核酸的性质 核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等 2 凝胶孔径的大小 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，表7-1列出不同凝胶浓度与其对应DNA分子的分离范围。 3 电场强度和电场方向 低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与电压成正比。 4 电泳环境 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。常用有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 的DNA分离效果好，TAE缓冲容量低，但便宜。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性.

核酸电泳的指示剂与染色剂 核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青 溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的dsDNA片段大致相同. 二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似. 指示剂一般与甘油、蔗糖或聚蔗糖400组成上样缓冲液.上样缓冲液的作用有①增加样品密度(比重)，使DNA沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可推测核酸电泳的速度和位置.③使样品溶液呈色，使加样操作更直观方便。 核酸电泳后需染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色. 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。银染色：银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，可将核酸带染成黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.

琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.

DNA的鉴定分析 原理 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365 nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。

【操作步骤】 1．琼脂糖凝胶板的制备：将1%~2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到60~70℃，倒入凝胶槽，厚度约3~5 mm，放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1~2 mm为止。 2．加样：样品中加1/5体积的6×凝胶上样缓冲液混匀，取15 μl加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。 3．电泳：电压2~10 V/cm 胶, 待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。 4．取出凝胶，浸于0.5 μg/ml EB溶液中染色20～30min后, 置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的DNA区带。

【注意事项】 1．加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。 2．上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。 3．EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液用后应妥善净化处理。 4．EB也可预加在凝胶中或上样缓冲液中进行DNA电泳时的同步染色，但EB是带正电荷的分子，电泳时向阴极移动，会影响DNA的实际迁移率。若延长DNA电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 μg/ml EB溶液中重新染色后检测。 5．加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1~0.5μg即可有良好的观察效果。 6．小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(＞10 V/cm)。应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。

真核组织总RNA提取(TRIzol试剂法) RNA紫外定性、定量分析 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定

RNA操作中的要求 抑制RNase活性是提取RNA的关键 实验中严格控制内源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 外源性RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。 各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。

防止RNA酶污染的措施 玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上，然后用高压法除去DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

原理 RNA的分离和纯化- TRIzol试剂法 经异丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern杂交分析、RT-PCR等； 存在于有机相的DNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到的DNA大小约20Kb，适用于PCR的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。

操作步骤 取150-200mg鼠肝组织置匀浆器中，加2ml Trizol冰上匀浆，将匀浆液1ml 转至Ep管中，静置５min。 加入0.3ml氯仿，振荡15s，静置2min。 4℃离心，12000rpm×15min，取上清<0.4ml转入新Ep管。勿触动中下层（沉淀可用于DNA提纯） 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 4℃离心，12000rpm×10min，弃上清。 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀,10000rpm×5min， 4℃，弃上清。 晾干，加入50μl双蒸水溶解。（15μl用于紫外测定；10μl用于变性电泳）

RNA的鉴定 一、紫外法定性、定量分析 260nm下OD值为1时相当于40μg/mlRNA。 取12μlRNA样品溶于双蒸水至3ml ，分别于260、280、230nm处比色并记录。 定量分析： RNA＝A260×核酸稀释倍数×40/1000（μg/ml） 纯度分析：A260读数在0.15-1.0之间才可靠。 RNA A260/A280=1.9-2.1 A260/A280<1.9，有杂蛋白，用酚/氯仿抽提; A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。 做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug

二、RNA的甲醛变性凝胶电泳 原理 在核苷酸碱基配对抑制剂甲醛、甲酰胺或尿素存在的情况下，RNA的迁移率和碱基的组成和构象无关，其电泳迁移率与分子量的对数呈反比关系。 可用于RNA的分离、Northern杂交、测定RNA的长度及回收寡核苷酸。

操 作 步 骤 配制1％琼脂糖变性凝胶： 5×MOPS︰2％琼脂糖凝胶︰甲醛＝1.1︰3.5︰1 制备变性的RNA（μl） 5×MOPS 2.0μl； 甲醛 3.5μl; 甲酰胺 10.0μl； 65℃温育15min，置冰浴10min，离心使样品集中； 加2μl 10×甲醛凝胶上样缓冲液； 预电泳，加样，90V电泳1h； 染色，将凝胶置于0.5μg/ml的EB溶液中浸泡30－40min，于紫外下观察RNA区带。

电泳结果 电泳结果可检测RNA的完整性，28S和18S真核细胞的比值约为2:1，表明无RNA降解，由下至上分别为 5S、18S和28S的RNA。 100 mg动物肌肉组织经过总RNA提取,用2.5μg进行RNA甲醛变性胶电泳结果。

PCR技术 PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖 目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

基本要素 1. Taq DNA聚合酶： 水生栖热菌(thermus aquaticus, Taq)的DNA聚合酶 ②无3’5’外切酶活性， 35轮0.25%错配，与原始模板有差别； 最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸 半衰期：92.5℃ 130min 95℃ 40min 97.5℃ 5—6min 变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， 2. 引物 人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条引物 10-50pmol /100l ◆设计原则： 1. Primer与双链DNA链互补 2. Primer 不要出现内部互补序列; (形成loop环，内部二级结构) 3. 注意减少Primer间互补序列; (一般不要超过3个互补bp,否则导致Primer形成dimer ) 4. Primer 5’未端可修饰、突变; 5. Primer 5’端增加碱基: ①内切酶识别点; ② ATG起始密码; ③TAA、TAG、TGA终止密码

3.模板 mRNA→逆转录→cDNA 可选：DNA DNA包括： 质粒 噬菌体 染色体DNA 较小 较大 ①目的gene是单拷贝 变性较易 变性较难 ②非常大，变性难 模板用量: Plasmid:lng; Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染

4.dNTP：四种脱氧核苷酸 5. Mg 2+ 终浓度：50M 注意：不稳定，保存时间长会失效 DNA聚合酶作用时需要Mg2+, 不同的酶需不同浓度Mg2+ Taq： 0.5-1.5mM终浓度，Mg2+ 对反应影响很大， pfu： Mg2+ 2-3mM，dNTP、Primer用量约增加一倍 外界影响： EDTA鳌合Mg2+ ,应选低浓度TE(10 mM Tris,1mM EDTA)；DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+ 结合， 降低Mg2+有效浓度, 如果扩增产物或效率不理想时，要注意调整合适的Mg2+浓度.

6.温度和时间： （1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于Tm值：Tm↑退火T↑； Tm↓退火T↓ 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 (3）延伸： 500nt---1min 500nt－－3min 一般：40－60sec

PCR扩增目的基因（以质粒DNA为模板） 总体积50μl 灭菌双蒸水 30μl 10xTaq buffer 5 μl dNTP 2 μl 上游引物 3 μl 下游引物 3 μl DNA模板 1 μl Taq酶 2 μl Mg2+ 4 μl PCR过程 95 0C，5min 变性：95 0C，30sec 退火：58 0C，45sec 延伸：72 0C，1min 30个循环 END： 72 0C，5min 40C，-- 2000rpm离心20sec 将PCR产物置于-200C冰箱冻存！

基因工程技术 基因工程 对不同生物的遗传物质--基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质从新组合然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。

基因工程技术 分——分离出带有目的基因的DNA片段。 切、接——将含目的DNA片段连接到载体分子上。 从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已扩增的目的基因，并做序列分析等鉴定。 将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞表达外源蛋白。

基因工程操作的主要步骤 载体 目的基因（外源基因） 开环载体DNA 目的基因 重组体 带重组体的宿主 限制酶消化 连接酶 转化 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 测序、PCR等

基因工程相关知识及原理 质粒(Plasmid) 质粒是独立于染色体外的环状双链DNA分子。大小可为1kb到200kb，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但依赖于宿主细胞复制的酶系。

质粒超螺旋结构

质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒：质粒的复制在寄主细胞松弛的控制下，不需要质粒编码的功能蛋白，而依赖于宿主提供的酶。每个细胞中含有10-200份拷贝。松弛型质粒的复制即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒。 严紧型质粒：质粒复制是在寄主细胞严格控制下，需要质粒编码的功能蛋白，与寄主细胞的复制耦联同步。往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝。

质粒在基因工程中的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒。 严谨型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。

质粒载体(Vector)： 具备的条件： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。 易于鉴定、筛选(具有筛选标志)； 在受体细胞中可以独立复制； 具有MCS（多克隆位点）； 易于导入受体细胞。

载体的结构 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 启始复制子( ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MCS, Multiple cloning site or polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。

Insert EcoRI XhoI 1.9kb

基因工程技术基本实验 感受态细菌制备、转化及Amp琼脂板筛选

实验目的和要求 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞、外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

感受态细菌制备及转化原理 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

感受态细胞(Competent cells) 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RbCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能摄取异源DNA的受体细胞，即感受态细胞。 受体细胞：原核-------大肠杆菌 真核-------酵母菌、动物、昆虫细胞

重组DNA导入宿主的方法 转化 transformation 转染 transfection 微注射技术 microinjection 电转化法 electrotransformation 电穿孔法 electroproration 微弹技术(基因枪技术) 脂质体介导法

转化（transformation） 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

转化的方法： 化学的方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。

转化子(transformant)是指接受外源DNA后获得新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。 质粒提取及内切酶图谱鉴定 DNA鉴定筛选法 PCR筛选重组子 DNA测序 α-互补(色斑法)法 直接筛选 选择性载体筛选 抗药性标志选择 标志补救 重组体 筛选 原位杂交(菌落) 分子杂交选择法 Southern blotting 表达产物免疫印迹法 免疫学方法 免疫沉淀法 酶联免疫检测分析 间接筛选 其他方法 网织红细胞液法 mRNA翻译检测 蛙卵细胞法

操作步骤 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) 1.取出液氮或低温冰箱中贮存的E coli DH5α菌在LB琼脂平板上划线 ，37 ℃过夜至长出单菌落。 2. 挑选琼脂培养平板上的单菌落, 接种到含有3 m1 LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1 m1接种至含有100 m1 LB培养基的500 m1烧瓶中，37℃剧烈振摇（200~300 rpm）培养约2~3 h，待OD600值达到0.3~0.4时将烧瓶取出立即置冰浴10~15 min。

以下皆需无菌、冰上操作 将细菌转移到一个预冷的1.5 ml灭菌的离心管中。于4℃离心，8000 g×1 min回收细胞。 弃去上清，将管倒置于滤纸上 1 min。 加 1ml 4℃预冷的0.1 mol/LCaCl2重悬菌体，冰浴30分钟。 4℃离心1 min, 回收菌体。弃去上清，将管倒置于滤纸上1 min。 加 0.1 ml 4 ℃预冷的 0.1 mol/LCaCl2重悬菌体，置4 ℃冰箱过夜。即可应用于转化。

细菌的转化 制备含100μg/ml Amp的固体LB琼脂平板(50℃时加入Amp)； 取100µl感受态细胞悬液于新Ep管中进行转化实验：加入5 µl重组质粒DNA轻轻摇匀，冰上放置30min； 42℃热休克90sec(勿超时!)，冰浴速冷1-2 min。 加入无抗生素的LB培养液400μl混匀，于37℃摇床温和振摇 (150～200rpm)45-60min;(细菌复苏并表达质粒的抗性基因) 平板培养:取样品培养液0.1ml，接种于含Amp 的LB琼脂平板上，涂匀（用无菌玻璃铺菌器涂抹）。 菌液完全被培养基吸收后(37℃ 平放20min），倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12～16h),生长出的克隆即为转化成功的菌落。

注意事项 转化实验中阳性对照，以估计转化条件和效率； 阴性对照，以消除可能的污染及便于查明原因。如阴性对照出现克隆，可能原因：1、感受态细胞被有抗生素抗性的菌株污染；2、选择性平板失效；3、选择性平板被某种具有抗生素抗性的菌株污染。如果阳性对照没有克隆长出，说明感受态细胞或转化缓冲液有问题。 细胞生长状态和密度: DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 质粒的质量和浓度: DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％ 用于转化的质粒主要是共价闭环DNA(cDNA)，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比。 防止杂菌和杂DNA的污染 ：无菌条件

氨苄青霉素抗性菌落数的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长抑制物质的缘故。 如检查Amp抗性，用转化细胞铺平板时密度应较低(每个90mm平板不超过104菌落)于37℃培养平板时不应超过20h。 Amp抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对Amp敏感的卫星菌落。

小量菌液的培养 挑选琼脂培养平板上的单菌落, 接种到含有3 mL LB（含Amp）培养基的试管或锥形瓶内，37℃振摇过夜。

质粒DNA提取的步骤 1 培养细菌质粒扩增 2 收集与 裂解细菌 3 质粒DNA的纯化

基本原理： DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。 纯化质粒DNA的方法常利用质粒DNA相对较小及共价闭环的 性质。如氯化铯-EB梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶 过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法。实验室中小量制备 质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简 单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足细菌 转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等。

细菌质粒DNA的提取方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10% SDS,一般用于质粒大量提取。

质粒DNA的小量提取---碱裂解法 SDS是一种阴离子表面活性剂，既能使细菌细胞裂解，又能使蛋白质变性，经SDS、EDTA处理后细菌细胞壁破裂，质粒DNA以及基因组DNA从细胞中释放出来，遇到强碱性pH 12.0(NaOH)环境均变性。用酸性乙酸钾中和溶液，并在高浓度盐存在的条件下，质粒DNA将迅速复性呈溶解状态，而染色体DNA由于分子巨大，难以复性，交联形成不溶性网状结构而与蛋白质易形成沉淀。离心后，质粒DNA存于上清中，而基因组DNA则与细胞碎片、蛋白质一起沉淀到离心管的底部。再进一步经苯酚、氯仿抽提和乙醇沉淀等纯化质粒DNA。

碱裂解法实验步骤 培养细菌：将含质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含相应抗生素的LB培养基，37℃培养过夜(12～16h); 取培养菌液1.5-3ml于Ep管中，离心10000rpm×30s,弃上清； 加100l预冷的溶液I，充分振荡重悬菌体，冰上放置5min; 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS (溶液II-变性液)，加盖颠倒6-7次混匀(不要剧烈振荡)，冰上放置3-5min(勿超时) 加入150ul预冷的乙酸钾溶液(溶液III),盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min; 12000rpm离心10min，上清<400 ul移入新Ep管. 加入等体积平衡酚混匀，离心12000rpm×5min，转上清液至新Ep管中。加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提一次，离心12000rpm×5min，转上清液至新Ep管中。 加RNaseA 2-5μl, 混匀，置37℃水浴30 min。加等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，离心10 000 rpm×5 min，转上清至新Ep管中。 加1/10体积的NaAC和2.5倍 100％冰乙醇混匀，14000rpm离心10min，弃上清; 沉淀用1ml 70％预冷的乙醇清洗一次， 12000rpm离心5min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。 加50μl TE溶解沉淀。 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定提取质量, 或-20℃保存备用或进行RE酶切实验。

注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！

重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。

重组DNA的酶切分析 目的基因非变性PAGE鉴定

实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶切分析和DNA非变性PAGE鉴定的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，非变性PAGE是高分辨率分离鉴定小分子双链DNA片段的有效方法。

限制性核酸内切酶(Restriction Endonuclease，RE)：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。RE不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。

1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型、命名法 3) 核酸限制性内切酶的基本特性 4) 同裂酶和同尾酶 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素

1) 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种细菌都能合成一种或几种核酸内切酶，用来限制外源DNA存在于自身细胞内，但细胞自身的DNA不受影响，因为细胞内还合成了一种修饰酶，能对自身的DNA进行修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

Ⅱ型*识别并固定切割专一的双链核苷酸顺序,是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。识别顺序是回文顺序。酶的切割可产生平头末端、粘性末端。 2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型: 随机切割核苷酸顺序没有专一性 Ⅱ型*识别并固定切割专一的双链核苷酸顺序,是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。识别顺序是回文顺序。酶的切割可产生平头末端、粘性末端。 Ⅲ型: 专一识别不对称顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。

3）限制性核酸内切酶的命名法 Hind Ⅲ EcoR I is from Escherichia coli. Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。

4） 同裂酶和同尾酶： 同裂酶： 有时两种RE的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。 例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

同尾酶 有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有可能产生一个新的酶切位点。如Xba1、Nhe1以及Spe1切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即 Bfa1的酶切位点。

5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。

实验步骤 质粒DNA的酶切（自提质粒） Hind III 1ul BamH I 1ul 10X Buffer 2 ul Plasmid DNA 6-8 ul ddH2O 10-8 ul *缓冲液随不同的酶而不同。 置于37℃水浴酶切1-2hr（<7h）。

酶活性的定义： 一个活性单位（U)，是指在50l反应体系中，37oC的条件下，经过1小时的反应时间，将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。 因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。

DNA酶切片段的非变性PAGE鉴定 凝胶的配制：10 ml 30％ 凝胶储存液 2.67 ml 5×TBE缓冲液（pH8.8） 2.0 ml ddH2O 5.3 ml 10％AP 70 μl 10％TEMED 60 μl

步骤 加样：酶切后的质粒DNA溶液，加入1/5倍体积的6×上样缓冲液。上样于点样孔。 电泳：90-100 V 染色：0.5 ug/ml EB

实验结果分析 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 未酶切质粒；2. EcoRI 单酶切；3. EcoR1+XhoI双酶切 M. 1kb DNA Marker.