实验动物质量控制 遗传质量控制 微生物质量控制 营养质量控制 环境质量控制

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实验动物质量控制 遗传质量控制 微生物质量控制 营养质量控制 环境质量控制 第四章 微生物学质量控制 实验动物质量控制 遗传质量控制 微生物质量控制 营养质量控制 环境质量控制

实验动物按微生物学控制的分类 按对微生物学质量的控制,可将实验动物分为四类: 无菌动物(Germfree animal, GF)和悉生动物(Gnotobiotic animal, GN) 无特定病原体动物(Specific pathogen free animal, SPF) 清洁动物(Clean animal, CL) 普通动物(Conventional animal, CV)

实验动物微生物等级 2001版国家标准根据微生物和寄生虫等级对实验动物等级进行了重新设定。 小鼠 清洁级 SPF级 无菌级

第一节 无菌动物(Germfree animal,简称GF) 定义:指用现有的实验手段检测,动物的体表体内不携带其它生命体(包括一切微生物和寄生虫)的实验动物。 饲养条件:无菌隔离器内 来源:第一代通过无菌剖 腹产术,人工哺乳获得; 以后通过无菌动物雌雄交 配繁殖或无菌剖腹产术, 保姆鼠代奶扩群。

种 类 培育者及育成时间 小 鼠 Pleasants,1959 大鼠 Reyniers1946;Gustafsson,1948 豚 鼠 Miyakawa1958; Tanami,1959; 兔 Wostmann1959; Luckey,1963 狗 Glimsedt,1946 猫 Bleby,1969 山羊、绵羊 Smith,1961,1966 猪 Whitenair,1960 马  Drummond等,1973 猴 Reyniers,1942 鸡 Reyniers,1943 鹌 鹑 Woodard等,1965;Miles,1966

无菌动物特点: 1.微生物特点: 在动物体内外任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫。 “无菌”是个相对的概念,只是根据现有的科学知识和检验方法在一定时期内不能检出病原体而已。随着科学技术的发展,现在认为是无菌的动物或许将来可以检出病原体而不是无菌动物。

2.形态学特点: 消化系统 (1)盲肠肥大, (2)肠道肌层薄,肠绒毛变细变短 (3)肝脏变小

循环系统 免疫系统 (1)心脏变小 (2)白细胞数变少,且数量波动范围小 (1)胸腺,淋巴组织,网状内皮系统发育不良 (2)脾脏小,无二级滤泡

2.生理学特点: 免疫功能 (1)血清中IgG、IgM水平低,几乎不存在丙种球蛋白和特异性抗体 (2)免疫应答速度慢,过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱

生长率 (1)不同种属不同 (2)无菌鸟类生长率高于同种普通鸟 (3)无菌大、小鼠与普通鼠差不多 (4)无菌豚鼠和无菌兔比普通的慢

生殖 (1)无菌大、小鼠略高于普通大小鼠 (2)豚鼠和兔繁殖能力比普通级低

代谢和营养 无菌动物血中含氮量少,肠管对水的吸收率低,代谢周期比普通动物长 体内不能合成维生素B和K,易产生这两种维生素的缺乏症

抗辐射能力 无菌动物抗辐射能力强,抗实验性烫伤和抗休克死亡能力也强于普通动物 寿命 无菌动物的寿命普遍长于普通动物

第二节 悉生动物(Gnotobiotic animal,简称GN) 定义:又称已知菌动物,指动物体内带有明确的微生物种类的动物。 饲养条件:无菌隔离器内 来源:人为将已知的微生物投给无菌动物,使其体内带有已知菌 单菌动物 双菌动物 多菌动物

悉生动物特点: 微生物特点 体内携带有已知微生物 来源 无菌动物植入微生物 饲养管理 必须饲养在温湿度恒定的百级空气净化的隔离系统中,实行严格的微生物控制。

其他 与无菌动物比较。 悉生动物肠道内存在细菌可以合成维生素,不会像无菌动物一样发生维生素缺乏症。 抵抗力、生活力较强,易于饲养管理。

无菌动物和悉生动物的应用 1、病因学的研究 如:猫瘟、龋齿的形成 2、微生物学中的研究 (1)微生物间的拮抗作用 (2)微生物和宿主之间关系 (3)病毒学研究

无菌动物体内既无抗原也无特异性抗体,处于一种“原始状态”,很适合用于各种免疫功能的研究。 3、免疫学研究中的应用 无菌动物体内既无抗原也无特异性抗体,处于一种“原始状态”,很适合用于各种免疫功能的研究。 如,无菌动物暴露于微生物,先产生α球蛋白,再产生β球蛋白,最后产生γ球蛋白。 制备高效价,无交叉反应的特异性抗体

4、肿瘤学研究 如,制备人体肿瘤模型需要免疫抑制动物,而普通动物给予免疫抑制剂后常继发感染死亡,所以可以应用无菌动物。 研究垂直传染的致癌病原,如白血病病毒。 某些微生物的代谢产物可以降解无害的苏铁素,使其致癌。

5、老年病学研究 无菌动物普遍寿命比普通动物长,说明微生物和机体老化有关。 普通大鼠寿命2年,而无菌大鼠寿命3—4年。

6、营养学的研究 无菌动物是研究营养的良好模型,很多营养成分是靠细菌产生的。如VB和VK是靠肠道细菌合成的,无菌动物体内不能合成VB和VK,所以可以用来研究哪些细菌合成了哪些维生素。

7、放射医学研究 无菌动物可以耐受大剂量的放射线照射。可用区别放射引起的症状和继发感染的症状。 8、毒理学研究 如:研究发现青霉素过敏是因为肠道菌代谢引起,而非青霉素本身。豆类中毒也是由肠道细菌的代谢活动引起的。

9、心血管病研究 实验证实肠道微生物可以分解胆汁酸,降低血液中胆固醇水平。 10、宇航中应用 可以用来携带地外微生物。

第三节 无特定病原体动物(Specific pathogen free animal,简称SPF动物) 定义:指不携带特定病原体(细菌、病毒、寄生虫),但带有未知的微生物群的动物。 饲养条件:屏障系统内 大规模生产/隔离器内 保种 最初来源:将无菌动物/ 悉生动物转移到屏障系统 中饲养繁殖

SPF动物特点: 1、微生物特点 SPF动物除一、二级动物应排除的病原体外,不携带主要潜在感染或条件致病和对研究实验干扰大的病原。 2、来源

3.饲养管理 SPF动物必须饲养在温湿度恒定的万级空气净化的屏障系统中,实行严格的微生物控制。

SPF动物的应用: 目前国际上公认SPF动物适用于所有科研实验,是国际标准级别的实验动物。它的应用价值在于它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究可能产生干扰的微生物。各种疫苗生产所采用的动物应为SPF动物。

第四节 清洁动物(Clean animal,简称CL动物) 定义:微生物控制级别介于SPF动物和普通动物之间的动物 饲养条件:屏障系统大规模生产 来源:SPF动物扩群 应用:各种科研、教学用大小鼠

清洁级动物特点: 1、微生物特点 清洁级动物比普通级动物要求排除的微生物和寄生虫多,但比SPF动物少。清洁级动物除肉眼观察无病外,尸体解剖时,主要脏器、组织无论是肉眼观看还是病理组织切片均应无病变。

2、来源 清洁动物来源于SPF动物、无菌动物、悉生动物或剖腹产动物。

3、饲养管理 清洁级动物饲养于温湿度恒定的万级空气净化的屏障系统中。 其所用的饲料、垫料、饮用水、笼器具等都经过消毒灭菌处理。 工作人员需换灭菌工作服、鞋、帽、口罩等进入动物室进行操作。

清洁级动物的应用: 清洁级动物是根据我国国情而设立的等级动物。 它较普通级动物健康,又较SPF级动物易达到质量标准,在动物实验中可免受动物疾病的干扰,其敏感性与重复性亦较好。 目前在我国已成为适用于科研的标准级别的实验物。

第五节 普通动物(Conventional animal,简称CV动物) 定义:不带有严重危害动物自身健康和人兽共患病病原体的动物。 饲养条件:普通开放环境 来源:经微生物学检查不带有上述病原体的动物,或SPF动物降级。 应用:豚鼠、兔、犬、猴等大动物的实验研究。

普通动物特点: 1、微生物学特点 要求不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病的病原。 2、饲养管理 饲养于开放系统。但仍然对温度,湿度,饲料,垫料,饮水,卫生等有一定控制。 3、生理学特点 外观健康,饮食排泄正常,无异常分泌物,无临床症状,脏器无眼观病灶。

普通动物的应用: 仅可作为生物医学中教学示教之用, 或作为某些科学研究为探索方法而从事的予试验之用, 不可供科研、生产和检定之用, 由于普通级动物繁殖力强,生产量大,生产成本低,适宜作一般性的教学实验和预实验用。

第六节 洁净动物与普通动物的比较 洁净动物通常是指来源于剖腹产、实行严格的微生物控制、饲养于空气净化系统设施内的动物,包括清洁动物、SPF动物、悉生动物和无菌动物。洁净动物与普通动物相比,在很多方面均存在一定差异。

一、微生物控制比较 种 类 饲育环境 说 明 无菌动物 隔离系统 无法检出任何生命体 悉生动物 隔离系统 确知带有的微生物 SPF动物 屏障系统 确知不带有的微生物 清洁动物 屏障系统 确知不带有的微生物 普通动物 开放系统 微生物情况不明确

二、对科研实验结果影响的比较 传染病 无 无 无 未知 寄生虫 无 无 无 未知 试验结果 明确 明确 明确 有疑问 GF SPF CL CV 传染病 无 无 无 未知 寄生虫 无 无 无 未知 试验结果 明确 明确 明确 有疑问 用动物数 少 少 较少 多或大量 统计价值 很好 可能好 较好 不准确 长期实验 好 好 可能好 困难 死亡率 很少 少 较少 高 长期实验成活率100% 90% 80% 40% 实验标准设计 可能 可能 可能 不可能 结果讨论价值 很高 高 较高 有疑问

总之,使用无菌动物、悉生动物、及SPF动物和清洁级动物,由于有明确的微生物背景和可控的饲育环境,可大大提高动物实验的重复性和准确性,因而得到广泛的应用。

三、生物学特性的比较 洁净动物与普通动物相比,在血液学、血液生化指标及主要脏器系数方面均产生一定变化。 如清洁级大鼠与普通大鼠相比,白细胞较少,其中中性粒细胞少,淋巴细胞相对增加;血清碱性磷酸酶、胆红素、胆固醇值较高;尿素氮、肌酐值比较低;空肠淋巴结、脾脏较轻;肺、肾组织形态比普通大鼠健康。

第七节 洁净动物的培育 一、无菌动物的培育 无菌动物的理论基础和实践依据:胎盘屏障和屏障观念。

1、无菌手术 小哺乳动物动物:子宫切除术(剖腹产) 大哺乳动物动物:子宫切开术(剖腹产) 鸟类:消毒卵

2、哺乳 人工哺乳 代乳

注意: 供胎动物:不携带垂直传播的微生物 手术时间的选择 手术速度 无菌操作 环境温度 防止羊水呛入呼吸道 手术后微生物的检查 代乳动物的准备

3.放入隔离器进行饲养

二、悉生动物的培育程序 (1)获取无菌动物 (2)准备好特定的微生物材料 (3)把上述材料转入无菌饲育隔离器 (4)在隔离器内给无菌动物授入微生物

三、SPF动物和清洁动物 将无菌动物或悉生动物饲养于屏障系统使其自然感染特定微生物以外的微生物,但应严格防范特定病原体的污染,并需要定期检查。

第八节 卫生防疫 一、传染病流行环节 1、传染源: 有症状或无症状的病原携带者 2、传播途径: 3、易感动物 传播途径: 水或食物传播 空气飞沫传播 虫媒传播 接触传播:直接或间接 垂直传播

二、防疫与隔离措施 1、小型实验动物一旦染病,不可用药治疗和疫苗接种 原因: 干扰实验结果 成为潜在感染源 经济上不合算

2、应采取严格的饲养管理和卫生防疫制度 预防和控制措施 预防措施 1)从有资质的实验动物供应商处采购动物 2)制定科学的饲养管理和操作规程,严格按操作规程进行饲养管理和动物实验 3)定期进行微生物学监测 4)彻底消灭饲养室内外的野鼠 5)大动物接种疫苗 2. 控制措施 1)重要传染病感染要及时捕杀、消毒、隔离 2)大动物隔离治疗 3)不明死亡原因要剖检明确诊断

第九节 实验动物常见的传染性疾病 传染性疾病对实验动物生产和动物实验研究的影响 引起动物死亡和质量下降(鼠痘、仙台病毒感染、兔瘟、犬出血性肠炎等) 人兽共患病(淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染、流行性出血热、B病毒感染

易污染实验动物组织培养的病毒 动物种类 病 毒 种 类 猿猴 犬 兔 豚鼠 仓鼠 大鼠 小鼠 鸡 病 毒 种 类 猿猴 犬 兔 豚鼠 仓鼠 大鼠 小鼠 鸡 SV40、腺病毒、疱疹病毒、肠道病毒、泡沫病毒 腺病毒、疱疹病毒、副流感病毒、呼肠孤病毒 痘病毒、乳多空病毒、疱疹病毒 疱疹病毒、副流感病毒、逆转录病毒 微小病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 微小病毒、疱疹病毒、冠状病毒 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、白血病病毒、冠状病毒 白血病病毒、腺病毒、疱疹病毒、粘病毒

一、常见人畜共患病毒性疾病 1. 流行性出血热病毒感染(Epidemic hemorrhagic fever virus infection) 病原:流行性出血热病毒(Bunyaviridae, Hantavirus) 流行病学: 传染源:带毒野鼠和实验大鼠 传播途径:咬伤接触传播,气溶胶吸入 易感动物:大小鼠及其它啮齿类动物 临床症状:大小鼠无临床症状,人感染后得流行性出血热,典型表现有发热、出血和肾脏损害三类主要症状

诊断:血清学检查,病毒分离 预防和控制: 预防:饲养区内外捕杀野鼠,不从无生产许可证单位购买动物。 控制:捕杀血清学检查阳性大小鼠鼠,消毒、隔离

2. 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染(Lymphocytic choriomeningitis virus infection) 病原:LCMV(Arenaviridae, Lymphocytic choriomeningitis virus) 流行病学: 传染源:感染LCMV的野小鼠或实验小鼠 传播途径:接触传播,垂直传播 易感动物:小鼠、仓鼠、人 临床症状:小鼠无症状,人流感样、脑膜炎

LCMV is transmitted by the common house mouse, Mus musculus, which sheds the virus in its urine.  Humans become infected by inhaling aerosolized particles of rodent excrement, by ingesting food contaminated with the virus or by direct contact of mucus membranes with infected fluids (lab and pets).

Lymphocytic choriomeningitis (LCM) virus, a rodent-borne arenavirus, can infect humans throughout temperate regions of Europe and North America ,Moreover, clinicians may confuse congenital LCM virus infections of infancy with other congenital infections, especially CMV or toxoplasmosis, because of their clinical similarities. Wright, R. et al. Pediatrics 1997;100:e9

诊断:血清学检查,样品脑内注射 预防和控制:彻底消灭饲养室周围的野鼠和家鼠,避免鼠类的排泄物污染的饮食,避免吸入被污染的尘埃。

3. 猴疱疹病毒感染(B-Virusinfection) 病原:Cercopithecine Herpesvirus Type 1 流行病学:传染源:感染B病毒的非人灵长类动物 传播途径:接触传播(咬伤、抓伤) 易感动物:猴、人 临床症状:发热、头痛、器官坏死、出血性休克、严重致死

诊断:血清学检查 预防和控制:对进入实验室的猴做彻底的检疫,避免接触野生猴类

流行病学:传染源:感染Rhabdovirus的犬、猫、狼和蝙蝠等 传播途径:接触传播(唾液) 易感动物:所有哺乳动物 4. 狂犬病(Rabies) 病原:Rhabdovirus 流行病学:传染源:感染Rhabdovirus的犬、猫、狼和蝙蝠等 传播途径:接触传播(唾液) 易感动物:所有哺乳动物 临床症状:潜伏期、前驱期、急性神经症状期和麻痹期即昏迷死亡期

狂犬病病毒的结构模式图 电镜下的狂犬病病毒

预防和控制:禁止野犬进入动物房周围,对实验犬和实验人员接种狂犬病疫苗 诊断:1. 狂犬病特异性抗原 2. 在脑组织中存在Negri体(狂犬病病毒包涵体) 3. 在脑组织或唾液中用细胞培养分离到病毒 预防和控制:禁止野犬进入动物房周围,对实验犬和实验人员接种狂犬病疫苗

二. 立克次体疾病 立克次体是介于细胞与病毒之间的微生物,具有以下特点:   ①需在活细胞内生长,在代谢衰退的细胞内生长旺盛;   ②具典型的细胞壁、有DNA和RNA,呈短小、多形性球杆状,染色后光学显微镜可以查见 ③对抗生素敏感

人畜共患的实验动物立克次体疾病 疾病名称 病原 感染媒介动物 人类临床症状 传染途径 昆士兰热:Q热 (Q fever) Coxiella burnetii 畜禽类(绵羊、山羊、牛、猪、犬、鸡) 发热、发抖、头痛、虚弱、不适、出汗,有些病例引发肺炎伴有咳嗽、胸痛等症状。另外也有急性或慢性肉芽肿型肝炎的报告 空气感染、消化道亦可感染、尿、粪便、乳汁污染均可感染 猫抓热 (Cat-Scratch fever) Bartonella henselae 猫、犬、猴、猪 伤口出现红斑丘疹数日后形成疱痂、淋巴结炎,发热、不适、厌食、头痛、脾肿大 咬伤、抓伤 立克次体痘或斑疹热(Rickettsial pox) Rickettwsia akari 小鼠、大鼠、田鼠 皮肤有丘疹、发冷、发热、头痛、肌痛 由螨虫传染

三. 人畜共患常见细菌性疾病 1. 沙门氏菌病(Salmonella) 病原:沙门氏菌 流行病学: 传染源:患病动物和无症状带菌动物 传播途径:消化道 易感动物:啮齿类、兔 临床症状:突然死亡,腹泻 诊断:临床症状,病原菌分离

Salmonella species are Gram-negative, flagellated facultatively anaerobic bacilli characterized by O, H, and Vi antigens. There are over 1800 known serovars which current classification considers to be separate species.

豚鼠的脾脏病变 小鼠肝脏病变

预防和控制:对动物的食物和饮水进行严格消毒,一旦发现有动物染病,立即扑杀并对环境彻底消毒。

1. 布氏杆菌病(Brucellosis) 病原:Brucella suis 流行病学: 传染源:患病犬、牛、猪、羊 传播途径:接触感染(口、皮肤、黏膜) 易感动物:犬、牛、猪、羊 临床症状:体重减轻、睾丸炎、不育 诊断:临床症状,病原菌分离

四. 常见的影响实验动物生产的疾病 1. 鼠痘(Mouse pox, Infectious ectromelia) 病原学:鼠痘病毒(Poxviridae, mouse poxvirus) 流行病学: 传染源:病鼠,野生小鼠很少发生 传播途径:接触传播、消化道传播 易感动物:小鼠(某些品系易感,某些品系抵抗) 临床症状:痘斑、脱脚、断尾

诊断:流行病学,临床症状,病毒分离,实验室检查 预防和控制: 预防:严格执行规章制度,不从无生产许可证单位购买动物。 控制:捕杀病鼠,消毒饲养室

2. 仙台病毒感染(Sendai virus infection) 病原学:仙台病毒(Paramyxoviridae, Sendai virus) 流行病学: 传染源:病鼠 传播途径:呼吸道 易感动物:所有实验动物 临床症状:肺炎

Sendai virus is a member of the paramyxoviridae Sendai virus is a member of the paramyxoviridae. It is a single-stranded RNA virus which is able to transfect both dividing and non-dividing cells. Its method of entering cells involves sialic acid and cholesterol which are common to many cell types. Sendai viral gene expression and replication are localized in the cytoplasm in contrast to most viruses that need to enter the nucleus. Sendai virus is non-integrating so gene expression following gene transfer is short-lived.

仙台病毒感染肺病变 对麻醉实验和吸入毒理学研究等产生严重干扰

诊断:流行病学,临床症状、实验室检查 预防和控制:引进动物时执行严格的检疫制度,发现感染鼠后及时扑杀,剖腹产重建鼠群

3. 鼠肝炎(Mouse hepatitis) 病原:鼠肝炎病毒(Coronaviridae, Mouse hepatitis virus) 流行病学: 传染源:隐性感染鼠、病鼠 传播途径:消化道,接触传播 易感动物:小鼠 临床症状:乳鼠死亡,裸鼠“waste syndrome”

感染鼠肝炎的裸鼠waste syndrome 裸鼠的肝脏病变

诊断:流行病学,临床症状、实验室检查 预防和控制:引进动物时执行严格的检疫制度,发现感染鼠后及时扑杀,剖腹产重建鼠群

4. 犬细小病毒病(Canine Parvovirus disease) 流行病学: 传染源:病犬 传播途径:消化道 易感动物:犬 临床症状:粪便呈咖啡色或番茄酱色样的血便,严重者机体休克、昏迷死亡或呈心肌炎型

诊断:流行病学,临床症状、实验室检查 预防和控制:禁止野犬进入动物房周围,饲养人员不得与宠物狗或其它草狗接触,一旦发现感染,则对其隔离或扑杀,并对环境做彻底消毒。

5. 犬瘟热(Canine Distemper) 病原:犬瘟热病毒( Canine Distemper Virus) 流行病学: 传染源:病犬或海豹等野生动物 传播途径:消化道 易感动物:犬 临床症状:鼻眼流浆液性分泌物 ,发热,食欲废绝、鼻镜干裂,或出现急性肠胃炎和神经症状

犬瘟热典型症状

诊断:流行病学,临床症状、实验室检查 预防和控制:禁止野犬进入动物房周围,饲养人员不得与宠物狗或其它草狗接触,一旦发现感染,则对其隔离或扑杀,并对环境做彻底消毒。

五. 常见的实验动物寄生虫病 1. 体外寄生虫(节肢动物) 病原:Ectoparasites(虱子、螨) 流行病学: 传染源:带虫动物 传播途径:接触传播 宿主:各种动物 临床症状:

诊断:临床症状、实验室检查 预防和控制:笼具和垫料要彻底消毒,一旦诊断出有外寄生虫病,应剖腹产重建动物群或重新引种,有经济价值的大动物可用杀虫剂治疗。

滋养体,假包囊,包囊寄生在人的除红细胞以外的有核细胞内。 2. 弓形虫病 病原:Toxoplasma gondii 生活史: 1.寄生部位: 滋养体,假包囊,包囊寄生在人的除红细胞以外的有核细胞内。 2.终宿主: 猫和猫科动物。 3.中间宿主:   人、小鼠、家鼠 其它哺乳类,鸟类,爬行类等 成熟卵囊,假包囊,包囊。 4.感染阶段:

感染途径: 经口感染。 经损伤的皮肤或粘膜感染。 经眼结膜感染。 经接触被卵囊污染的土壤,水源感染。 经输血,器官移植感染。 经节肢动物携带感染。 经猫,狗唾液感染。

感染弓形虫多数为隐性感染。主要危害眼和N系统 孕妇常有流产,早产,死产。死胎或畸胎。 幼龄大鼠常导致致死性肺炎

预防和控制: 禁止猫进入动物房周围,一旦感染扑杀整个感染群

第十节 微生物和寄生虫监测 一、监测意义 1、保护人员健康 2、保证动物质量 3、确保动物实验结果准确可靠 二、微生物、寄生虫监测等级国家标准 级别越高的实验动物,监测的微生物和寄生虫的种类就越多。

三、监测程序