医学细胞生物学与医学遗传学教研室 泸州医学院 遗传病的产前诊断 医学细胞生物学与医学遗传学教研室 泸州医学院

实验目的 1、初步掌握遗传病的产前诊断实验设计原则。 2、通过对具体遗传性疾病的诊断设计，培养运用遗传学现代技术解决医学实际问题的能力。

实验设计的基本思路 1、要明确实验目的(要解决什么问题)。 2、明确达成实验目的所需要应用的基本原理或知识。 3、明确理论上应达到何种实验效果，或如何判断实验结果。 4、要实现实验目的需要的实验试剂、仪器、具体方法步骤。 5、应尽量仔细全面的设计好实验方案(多查资料、思考、讨论)，并注意在实验中避免可影响实验结果的因素。 6、写好实验设计报告

实验设计报告的内容要求 实验设计报告的内容应包括： 1、实验目的 2、实验原理 3、所需实验材料、器材、试剂 4、实验步骤和操作方法 5、结果观察或判断 6、注意事项

产前诊断(prenatal diagnosis) 又称宫内诊断。是在遗传咨询的基础上，对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形做出准确的诊断。

案例1分析 先天愚型为染色体病，张某夫妇经检查核型均正常，所以，张某生育先天愚型患儿的风险同群体发病率。张某表姐虽然生育了先天愚型患儿，并不影响张某生育患儿的风险。 但张某中孕期唐氏筛查显示高风险。

案例1分析 中孕期针对先天愚型患儿的筛查（唐筛）主要是检测孕妇血清AFP、hCG、uE3。 通常胎儿为21三体时，AFP、uE3值均降低（一般分别低于0.6MoM和0.55MoM ），而hCG明显升高（一般为2.0MoM以上），以hCG升高最敏感，大多数产前诊断中心以风险率为1:270作为分界值。如果风险值≥1:270，称为筛查阳性或高风险。即有可能是21三体。 应建议筛查阳性者进行产前胎儿染色体核型分析。 核型分析是确诊染色体病的方法

案例1分析 张某已孕15周，应建议用羊膜穿刺法抽取羊水作羊水细胞培养及核型分析。

基本流程 抽取羊水 羊水细胞培养 羊水细胞染色体标本制备 核型分析

材料：羊水 器材： 穿刺针、酒精灯、10ml培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、倒置显微镜、离心机、刻度离心管、吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、镊子、烧杯、记号笔、注射器等。 试剂： 羊水细胞培养基、小牛血清、青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶、秋水仙素、0.075mol/L KCl、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（pH6.8）。

基本流程 抽取羊水 羊水细胞培养 羊水细胞染色体标本制备 核型分析

生育指导 若核型正常：可生育 若为先天愚型患儿：建议流产

羊水细胞培养的质控 1、每个病人必须接种两个培养瓶，分别放置于不同的培养箱，换液时留原培养液于一新培养瓶，继续培养直至有足够的中期分裂相供分析。 2、定时消毒无菌室、培养箱，超净台并记录。 3、培养基的批号（不同批号可能质量不同）、保存、解冻条件，观察有无污染，使用时温度情况。 4、定时专人观察培养箱温度、湿度及CO2的浓度并记录。

案例2分析 案例中王某及其丈夫均为α地贫基因携带者（分别为标准型α地贫；静止型α地贫），其生育患儿的可能性为高风险。 应进行产前诊断。

案例2分析 α地贫为分子病。 受累基因为α珠蛋白基因。 分子遗传基础：多为基因缺失 其产前诊断通常使用基因检测方法。

α地贫产生的分子遗传基础 α0 缺 失 型 α+ α+   1 2 1 东南亚缺失型 （-αSEA ） 约20kb   1 2 1 5‘ 3’ 16pter-p13.3 东南亚缺失型 （-αSEA ） α0 缺 失 型 约20kb   1 2 1 5‘ 3’ 16pter-p13.3 左侧缺失型 (-α4.2) α+ 4.2kb   1 2 1 5‘ 3’ 16pter-p13.3 右侧缺失型 (-α3.7) α+ 3.7kb

案例2分析 王某孕7周，可建议用绒毛吸取术吸取绒毛作绒毛细胞的基因诊断。也可建议到中孕期后通过羊膜穿刺法抽取羊水作羊水细胞的基因诊断。

基本流程 绒毛取样 提取绒毛细胞DNA DNA印记杂交 裂口PCR（gap-PCR）

材料：绒毛 器材： 绒毛取样器、镊子、眼科剪、尖嘴钳、恒温水浴箱、低速离心机、PCR仪、高速多功能低温离心机、电泳仪及电泳槽、凝胶成像仪、核酸蛋白检测仪、漩涡振荡器、Eppendorf 管、移液器等。 试剂： 高保真或长片段PCR扩增试剂盒（BM公司产品）、 通用基因组DNA提取试剂盒、DNA marker、PCR引物、磷酸盐缓冲液（1×PBS） 5×TBE、溴化乙锭（EB）、琼脂糖等。。

基本流程 绒毛取样 提取绒毛细胞DNA DNA印记杂交 裂口PCR（gap-PCR）

生育指导 若正常（αα/ αα ）：可生育； 若为HbH病患儿（α-/-- ）：建议人工流产； 若为α0地贫杂合子（αα/-- ）或α+地贫杂合子（αα/α- ）：则告之患儿无明显异常，但在生育时有可能将异常基因传递给子代并有可能造成子代患病。由父母权衡利弊后做出选择。

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抽取羊水 由有经验的妇产科医生常规消毒、B超引导下经腹羊膜腔穿刺术抽取羊水20ml（注意无菌操作），立即分装入2个无菌离心管中，以1000转/分离心10分钟，在无菌工作台上吸出上清液，每个离心管中留下约0.5ml羊水，用吸管轻轻吹打混匀后制成羊水细胞悬液。

羊水细胞培养 市面有多种羊水专用完全培养基出售。 主要成分为：基础培养基+胎牛血清 在准备好的羊水细胞悬液中加培养基2～4ml，混匀，移至培养瓶中（25mm2），紧闭瓶口，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中静置培养5天，此后在倒置显微镜下检查细胞生长情况（注意换液和镜检）。一般培养4～5天后，细胞贴壁生长，7天左右细胞能生长成一个个小群落，第9～11天即可制片（有10个克隆时，镜下见细胞大、亮、圆、重叠）。 终止培养前均在无菌间操作，注意避免污染

羊水细胞染色体标本制备 终止培养 收获细胞 低渗处理 固 定 制 片 显 带

羊水细胞染色体标本制备 1、终止培养和收获细胞 镜下观察见细胞生长旺盛时，于培养基中加入秋水仙素，使其终浓度为0.01～10ug/ml，继续培养4小时左右后，移入离心管中，加入0.025％胰蛋白酶0.5～1ml消化，使细胞从瓶壁脱落。然后离心收集细胞。（注意加胰酶前培养瓶要用生理盐水洗一下，以去除小牛血清）。 大量做时一般采用机械法——用塑料吸管直接将细胞从培养瓶壁上刮下来，再用生理盐水冲洗后，离心。

羊水细胞染色体标本制备 2、低渗处理 加入低渗液2ml，混匀，37℃水浴低渗5～10分钟。 低渗液：0.4%Kcl+0.4%枸橼酸钠 1:1的混合液（临时配）

羊水细胞染色体标本制备 3、固定 （1）预固定：加入1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3:1），用吸管小心吹打、混匀，离心弃上清液。 （2）固定：加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20min。离心弃上清液。 （3）再固定：加入8ml固定液，轻轻吹打细胞团制成细胞悬液后。室温下静置15min或更长时间，离心弃上清液。 离心力为500g左右，即1000～2000rpm，10分钟

羊水细胞染色体标本制备 4、制片 根据细胞数量的多少适当加入数滴（0.2～0.4 ml）新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。用吸管吸取少量细胞悬液，滴2～3滴于预冷（1～4℃）的载玻片上，立即对准载玻片吹一口气以助细胞的分散并立即将玻片在酒精灯火焰上来回过几下（勿全烤干），放37℃烤箱过夜。

羊水细胞染色体标本制备 5、显带 用PH为7.5的磷酸缓冲液配制浓度为0.4mg%胰酶消化液，在37度水浴箱内消化30秒左右（时间需自己尝试）；流水冲洗，Gimsa染色5分钟，流水冲洗，晾干，待检。

核型分析 镜下核型分析，判断羊水细胞核型正常与否。

绒毛取样 分为经腹部取样和经宫颈取样。 经宫颈取样：B超检查确定胚胎大小、有无心血管搏动、在子宫内的位置；同时判别阴道的洁净度，防止取样导致宫内感染。用1‰新洁尔灭冲洗阴道后，用卵圆钳固定子宫颈，根据妇查及B超提示选择角度及深度将绒毛取样器伸到合适位置，抽出约10ml绒毛组织，立即注入盛有无菌生理盐水的玻璃器皿内。并在低倍镜下检查是否为绒毛。如果末查见绒毛而为蜕膜组织时，可换方位再行取材。

提取绒毛细胞DNA 1、清洗：取一干净培养皿，内加预温的（37℃）D-Hanks液10ml，将抽出的绒毛组织置于培养皿中，反复冲洗，去除血污。 2、DNA提取：按相应DNA提取试剂盒的要求提取DNA并检测提取DNA的纯度。

DNA印记杂交（Southern Blot） 为诊断传统技术。 利用α-珠蛋白基因探针（1.8kb）与经BamHⅠ和/或BglⅡ限制性酶切基因组DNA的印记杂交结果，可以明确诊断α-珠蛋白基因各种缺失突变基因型。

DNA印记杂交（Southern Blot） 为诊断传统技术。 利用α-珠蛋白基因探针（1.8kb）与经BamHⅠ和/或BglⅡ限制性酶切基因组DNA的印记杂交结果，可以明确诊断α-珠蛋白基因各种缺失突变基因型。 该法准确可靠，但操作繁琐，而且依赖同位素，难以推广。

裂口PCR（gap-PCR） 检测原理： 根据基因缺失后，在等位基因留下一裂口(gap)，在缺失区的两端各设计一条引物，当存在基因缺失时，扩增片段较正常等位基因短，或者因缺失区较大（通常2kb以上），正常等位基因无扩增带，借此鉴别基因缺失。

裂口PCR（gap-PCR） 设计8种PCR引物在α基因簇区域的位置。

裂口PCR法诊断α地贫示意图 A：人α基因簇物理图。实框代表功能基因，空框代表假基因。虚线表示- -SEA缺失区。图下方为引物位置。 B： α基因簇区同源（X,Y,Z box）和非同源区（Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ）及- α3.7、 - α4.2缺失区与PCR产物大小

裂口PCR（gap-PCR） 设计8种PCR引物在α基因簇区域的位置。 设计A、B、C、D四种不同的PCR反应体系，用高保真或长片段PCR扩增试剂盒（BM公司产品）扩增后，因基因型的不同，可得到不同大小片段的PCR产物，由此可对不同缺失型α地贫进行鉴别诊断。

α地贫gap-PCR产物大小（bp） 等位基因 PCR反应体系 A B C D αα － 298 446 2271 233 1865 A4/A9 P51/P52 P51/P54 P55/P54 P71/P72 P71/P52 P55/P52 αα － 298 446 2271 233 1865 --SEA 570 -α4.2 1596 -α3.7 2013 ααα3.7 2123

α地贫gap-PCR产物大小（bp） 等位基因 PCR反应体系 B C D αα 2271 － 233 1865 --SEA -α4.2 1596 -α3.7 2013 ααα3.7 2123

裂口PCR（gap-PCR） 该法较Southern印迹法简便、快速，不需使用同位素。

α地贫产生的分子遗传基础 非 缺 失 型   1 2 1 5‘ 3’ 缺陷类型 突变分子基础 基因型 Hb CS 142UAA（终止）→CAA（谷氨酰胺） α+ Hb QS 125CTG（亮）→CCG（脯氨酸）   1 2 1 5‘ 3’ 16pter-p13.3 1 31 32 99 100 141

非缺失型基因诊断 突变性质已知： 可应用各种等位基因特异性PCR诊断技术对已知点突变性质的点突变进行诊断，如：PCR-ASO、PCR-SSCP、PCR-RFLP、PCR-DGGE等。 若点突变性质未知：则应全长筛查α-珠蛋白基因序列，才能发现可能存在的基因点突变。