第二章 微生物的纯培养和显微技术

1、本章学时数：3学时 2、教学目的与要求：通过本章的课堂教学，向学生介绍进行微生物学研究的基本技术，即无菌技术、纯种分离技术、培养技术和显微技术，使他们了解微生物学的基本研究方法和研究手段，为后面介绍其他微生物学相关知识打下基础。 3、教学重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。 4、教学难点：微生物的分离和纯培养技术（如选择培养），为了解决难点内容的教学问题，拟采用：多媒体动画的形象教学。 5、要求阅读的文献资料： ⑴《微生物学教程》，周德庆，高等教育出版社，1993 ⑵ “Brock's Biology of Microorganism 9TH”， Michael T. Madigan John M. Martinko Jack Parker，Prentice Hall，1999 ⑶ “Microbiology”， Lansing M. Prescott,Donald Klein, John Harley，McGraw-Hill Higher Education，2002及其中译本“微生物学”，沈萍、彭珍荣主译，高等教育出版社，2003

第一节 微生物的分离和纯培养 一、无菌技术 1、微生物培养的常用器具及其灭菌:最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌 左图是高压蒸汽灭菌锅 注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。

2、接种操作

无菌操作箱及其操作

二、用固体培养基获得纯培养

铜绿假单孢菌的菌落特征

弗氏志贺氏菌的菌落特征

粘质沙雷氏菌的菌落特征

细菌的菌落： 　　单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。 可作为鉴定细菌种的依据。

沙门氏菌的菌落特征

霉菌的菌落

霉菌的菌落

霉菌的菌落

霉菌的菌落

1、平板涂布分离法（Spread Plate） Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod. 简单易行，但易造成机械损伤 先用固体培养基制成无菌平板,然后将一定稀释度的少量样品(一般是0.2_0.5ml)加到平板上,并用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面,经过培养后挑取单个菌落. 是最常用的方法.

2、稀释倒平板法

3、平板划线分离法（Streak Plate） An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar. 特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增多而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

4、稀释摇管法（厌氧培养法） 高层琼脂柱 .

厌氧罐 anaerobic jar                                      <>                                    <>                                  <>

厌氧培养装置

三、用液体培养获得纯培养 首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.

四、单细胞（单孢子）分离法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。 用途：高度专业化的开学研究 用途：高度专业化的开学研究

为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。 五、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。 ＊1、利用选择培养基进行直接分离 ＊2、富集培养 ＊利用选择培养基进行直接分离 根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有一定特征，然后挑取单菌落。 分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上分离。 分离蛋白酶产生菌，可在培养基中加入牛奶或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透明的蛋白质水解圈。 ＊富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。 富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。 例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后在进行培养。

富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。 例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后在进行培养。 ＊利用选择培养基进行直接分离 根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有一定特征，然后挑取单菌落。 分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上分离。 分离蛋白酶产生菌，可在培养基中加入牛奶或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透明的蛋白质水解圈。 ＊富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。 富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。 例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后在进行培养。

1、选择培养基分离法 1 ml 1.dilute sample 9 ml 10 100 1000 104 105 106 107 高氏培养基 10 100 1000 104 105 106 107 牛肉膏培养基 高氏培养基 土豆培养基

2、富集培养

六、微生物的保藏技术： 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种 原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）

微生物菌种保藏的方法 菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上

1、传代培养保藏方法： （琼脂斜面、半固体、液体） ①低温保藏法 方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 ②石蜡油低温保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。 2、冷冻保藏——低于－70℃ ③液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（ -196℃）。或低温冰箱 适用于各种微生物的较理想的保藏方法 1）暂时保藏法——斜面保藏 方法：斜面置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 优点：适用于各种微生物、简便易行、易 于观察； 缺点：保藏时间短、传代频、易退化、易 污染、工作量大。 改良方法：橡皮塞取代棉塞、加矿油 2）长期保藏法 原理：运用干燥、低温和隔绝空气等手段，降低 微生物菌种的新陈代谢速率，使菌种的生 命活动处于半永久性的休眠状态，以达到 长期保存的目的。 方法： 砂土管法 真空冷冻干燥法 液氮法 1）砂土管法： 干法：（适用于部分真菌、放线菌）将斜面上 孢子刮下，接种于无菌砂土管中（砂 装试管2/5)，搅拌均匀。 湿法：斜面中加3~5ml无菌水制成菌悬液，取菌 悬液10滴加入砂土管，以管内砂全部湿 润为宜。 将砂土管置于干燥器中真空干燥，低温或室温下保藏 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏。 保藏时间几至几十年。 2）真空冷冻干燥法 3)液氮超低温保藏法：

加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。 3、干燥保藏法 ④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。 ④真空冷冻干燥法 在干燥的条件下又保持真空来保藏菌种。 原理：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥， 使微生物细胞处于半永久的休眠状态，以达到长 久保藏的目的。 方法：用无菌脱脂牛奶作保护剂，加入3ml于斜面中制成 菌悬液，分装在安瓿中速冻真空干燥。 真空度维持在0.1~0.3mmHg,悬液维持冻结状， 水分不断升华，至菌体混合物呈疏松状，熔封。 优点：适用于各种微生物；便于大量保藏；可避免污染， 菌种存活时间长（几到几十年） 缺点：手续繁琐。 ⑤液氮超低温保藏法 方法：用10%甘油、二甲亚砜或蔗糖和吐温80 作保护剂，将菌种分散于其中，或将长 菌的琼脂块放入保护剂中，熔封后迅速 降温至-35℃。预冻后保存在液氮超低温 冰箱中（ -196℃）。 优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法 缺点：需专门设备 使用时速融，30 ~40℃水浴摇动，融后 以无菌手续开启

干法保藏菌种的方法 滴入小试管（在放入大试管干燥器中） 藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法 （L-干燥 法） 冷冻真空干燥法 藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法 （L-干燥 法） 冷冻真空干燥法 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒） 球块状载体（硅胶、瓷球） 合适的载体 有机基质（曲料、麦粒） 滤纸片 薄片状载体 明胶小片 （滴在蜡纸板上干燥而成） 血清蛋白小片（…乙烯薄膜… ）

几种常用菌种保藏方法的比较 方法名称 主要措施 适宜菌种 保藏期 评价 冰箱保藏法（斜面） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法 冷冻干燥法 低温 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法 冷冻干燥法 低温 低温、缺氧 干燥、无营养 干燥、无氧、低温、有保护剂 各大类 细菌、酵母菌 各大类** 产孢子微生物 3~6月 6~12月 1~2年 1~10年 5~15年以上 简便 简便有效

国内外菌种保藏机构： 菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、 菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以 及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）

一显微镜的种类及原理 普通光学显微镜

暗视野显微镜

相差显微镜

荧光显微镜 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（如下图）； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。

荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），

1933年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。 用电子束作光源，用电磁场作透镜,由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

透射电子显微镜工作示意图（左）和照片（右）

扫描电子显微镜

人类血细胞SEM照片

二、显微观察样品的制备 1、光学显微镜的制片：活体（压滴法）；染色

简单染色 制备涂片标本→染色 涂片 干燥 固定 水洗、吸干 镜检 染色1min

扫描电镜样品的制备：标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 2、电子显微镜的制片 透射电镜的样品制备 ⑴负染技术     负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果分辨力可达1.5nm左右。 ⑵投影技术 见P28 ⑶超薄切片     通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片（图2-13），切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差。 扫描电镜样品的制备：标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 扫描电镜工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。

第三节 显微镜下的微生物 一、细菌和古细菌 1、细菌的形态和排列 球状 基本形态 杆状 螺旋状

1、球菌 细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分 裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。

单球菌： 细胞分裂沿一个平面进行，新个体分散而单独存在. 如尿素微球菌(Micrococcus ureae)

双球菌： 细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列. 如肺炎双球菌 (Diplococcus pneumoniae) Division along the same plane forms chains; 2 cocci together - Diplococcus .  4 - 20 in chains - Streptococcus.

链球菌： 细胞沿一个平面进行分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状. 如： 乳链球菌 （Streptococcus lactis） 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae) 溶血链球菌 （ Streptococcus hemolyticus) 链的长短往往具种的 特性。 ◆Spherical is called coccus. ◆Division along the same plane forms chains; 2 cocci together - Diplococcus .  ◆4 - 20 in chains - Streptococcus.

四联球菌： 细胞分裂是沿两个相垂直的平面进行，分裂后每四个细胞特征性地连在一起，呈田字形. 如四联微球菌 （Micrococcus tetragenus） Division along 2 different planes - Tetrads

八叠球菌： 细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌特征性地连在一起成立方体形. 如藤黄八叠球菌 （Sarcina ureae) Division along 3 planes regularly - Sarcinae

葡萄球菌： 细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群体，犹如一串葡萄。 如： 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 白色葡萄球菌（Staphylcoccus albus) ◆Division along 3 planes regularly - Sarcinae ◆ Division along 3 planes irregularly - Staphylococci

2、杆菌 细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较 稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较 大变化。

杆菌(bacillus)及其排列状态 梭状芽孢杆菌 长杆菌 短杆菌 杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。 杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、“八”字状等。 一般情况下,同一种杆菌的宽度比较稳定,但它的长度经常随培养时间、培养条件的不同而有较大的变化。 Rod shape is called Bacillus. ◆ Two bacilli together - Diplobacilli ◆Chains of bacilli are called Streptobacilli ◆ Palisades - Rods side by side or in X, V or Y figures 梭状芽孢杆菌 长杆菌 短杆菌

弧菌 3、螺形菌 螺旋菌 螺旋体菌

螺旋菌(spirilla) 螺旋状的细菌称为螺旋菌。 根据其弯曲情况分为： 弧菌（vibrio)：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌 螺旋菌(spirillum)：螺旋满2—6环，螺旋状 例：干酪螺菌 螺旋体(spirochaeta)：旋转周数在6环以上，菌体柔软。 例：梅毒密螺旋体 螺旋不满一圈称为弧菌(vibrio)，满2~6环称为螺旋菌(spirllum)，旋转周数在6环以上的称为螺旋体(spirochaeta)。 弧菌（vibrio）：弧菌螺旋不满一环。如Vibrio comma（逗号弧菌，即霍乱弧菌V.cholerae）。 螺菌（spirillum）：螺菌为2~6环，细胞小而硬。如Spirillum minus（减少螺菌）、S.desulfericans（脱硫螺菌）。 螺菌容易与螺旋体混淆，要注意区别，螺旋体不是细菌，它是属于螺旋体目的原核微生物，菌体细长柔软，没有细胞壁和鞭毛，而螺菌细胞具有细胞壁和鞭毛。 ◆ Spiral shape that is rigid is called Spirillium.  If the organism is flexible and undulating, it is called Spirochete. Vibrio cholerae

柄细菌的特征形态电镜照片。 a）双鞘不粘杆菌；b）游离臂微菌； c）普氏绿臂菌；d）柄杆菌

鞘衣菌 Sphaerotilus natans（a）相差显微镜照片（b）透射电镜超薄切片

a）星形细菌（Stella，a star-shaped bacterium）；b）方形细菌（square-shaped bacteria ）。左为模式图，右为照片

放线菌概述 分布：含水量较低、有机物丰富、呈微碱性的土壤中。估计每克土壤中约含放线菌孢子107个。 Actinomycetes是一类具有丝状分枝的单细胞，主要以外生孢子的形式繁殖，革兰氏阳性，与细菌同属原核微生物。放线菌菌菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状呈放射状生长，并因此而得名。放线菌有特殊的土霉味。 分布：含水量较低、有机物丰富、呈微碱性的土壤中。估计每克土壤中约含放线菌孢子107个。 应用：放线菌对人类最突出的贡献就是它能产生大量的、种类繁多的抗菌素。放线菌还是酶类、维生素的生产菌；有的放线菌有固氮能力；放线菌在自然界物质循环中也起着重要作用，由于它们具有较强的分解复杂有机物的能力，对于土壤肥力的提高也有重要作用。 危害：只有极少数放线菌对人类构成危害，某些Actinomyces（放线菌属）菌种引起动物放线菌病（皮肤、脑、肺和足部感染），某些Nocardia（诺卡氏菌属）引起人和动物的诺卡氏菌病；还有少数放线菌能引起植物病害。 Actinomycetes: Unicellular filamentous microorganisms that branch monopodially or more rarely dichotomously and form radiating colonies; mainly found in the soil, and cause of its characteristic odor. 第二节 放线菌——Actinomycetes 放线菌是原核微生物的标志： 1）有原核， 2）菌丝直径与细菌相仿， 3）细胞壁的主要成分是肽聚糖， 4）有的放线菌产生有鞭毛的孢子，其鞭毛类型与细菌相同， 5）放线菌噬菌体的形状与细菌的相似， 6）最适生长Ph与多数细菌的生长Ph相近，一般呈微碱性， 7）DNA的重组方式与细菌相同， 8）核糖体同为70S， 9）对溶菌酶敏感， 10）凡细菌所敏感的抗生素，放线菌也同样敏感。 分布：含水量较低、有机物丰富、呈微碱性的土壤中。估计每克土壤中约含放线菌孢子107个。 应用：截止到1978年，已发现的抗生素5128种，放线菌产生的抗生素3165种，占总数的61.7%，其中87.5%为Streptomyces（链霉菌属）共2769种。 放线菌还是酶类、维生素的生产菌；有的放线菌有固氮能力；放线菌在自然界物质循环中也起着重要作用，由于它们具有较强的分解复杂有机物的能力，对于土壤肥力的提高也有重要作用。 危害：只有极少数放线菌对人类构成危害，某些Actinomyces（放线菌属）菌种引起动物放线菌病（皮肤、脑、肺和足部感染），某些Nocardia（诺卡氏菌属）引起人和动物的诺卡氏菌病（皮肤、肺和足部感染等），还有少数放线菌能引起植物病害（马铃薯和甜菜的疮痂病）。

放线菌与细菌的比较 同为单细胞，菌丝比真菌细，其直径与细菌接近； 同属原核生物。无核膜、核仁和线粒体等。核糖体70S等； 胞壁含磷壁酸，二氨基庚二酸，不含几丁质，纤维素；G+; 对环境的要求与细菌相近； 对溶菌酶敏感； 对抗生素的反应向细菌。 工微—67 放线菌是原核微生物的标志： 1）无核膜， 2）菌丝直径与细菌相仿， 3）细胞壁的主要成分是肽聚糖， 4）核糖体同为70S 4）有的放线菌产生有鞭毛的孢子，其鞭毛类型与细菌相同， 5）放线菌噬菌体的形状与细菌的相似， 6）最适生长Ph与多数细菌的生长Ph相近，一般呈微碱性， 7）DNA的重组方式与细菌相同， 8）核糖体同为70S， 9）对溶菌酶敏感， 10）凡细菌所敏感的抗生素，放线菌也同样敏感。 因为：（一）细胞的形态结构、代谢特征、对噬菌体和抗生素的敏感性：均与细菌相同，所以：在Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. (伯捷氏细菌系统分类手册） Vol.4 上归在分枝菌纲(Actinomycetes) 总之，放线菌是一类介于细菌和真菌之间，而更接近于细菌的原核生物。所以：在Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol.4 上归在分枝菌纲(Actinomycetes)

匍匐生长于培养基内，吸收营养，也称基内菌丝。一般无隔膜， 直径0.2-0.8 mm，长度差别很大，有的可产生色素。 1、营养菌丝 匍匐生长于培养基内，吸收营养，也称基内菌丝。一般无隔膜， 直径0.2-0.8 mm，长度差别很大，有的可产生色素。 2、气生菌丝 营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养 菌丝上，可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下观察，颜色较深 ，直径较粗（1-1.4 mm），有的产色素。 3、孢子丝 气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢 子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。其形状和排列方式因种而异，常 被作为对放线菌进行分类的依据。

放线菌孢子丝类型： 二级轮生 丛生 钩状 紧螺旋 松螺旋 一级轮生 周德庆—41 孢子丝（又称产孢丝或繁殖菌丝），是气生菌丝发育到一定程度时其上分化出可形成孢子的菌丝即为孢子丝。孢子丝的形状和在气生菌丝上的排列方式随菌种而异。 图——22 链霉菌的各种孢子丝形态 描述孢子丝形状是指它的：直形、波曲和螺旋形；螺旋数目、疏密程度、旋转方向等。孢子丝的排列方式有交替着生，丛生或轮生。 二级轮生 一级轮生

放线菌的繁殖方式 横隔孢子基内菌丝或气生菌丝横隔分裂形成，孢子常为球杆状，体积大小相似，又称节孢子或粉孢子。 放线菌的繁殖：放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可借菌丝断片（液体培养时）进行繁殖。无性孢子主要有以下三种： 分生孢子、孢囊孢子和横隔孢子。 分生孢子(conidiospores)：在气生菌丝顶端形成成串或单个孢子，菌丝分裂形成。 孢囊孢子在气生菌丝顶端或基内菌丝顶端膨大或盘卷缠绕形成孢子囊，在孢子囊内形成孢囊孢子。孢囊：菌丝细胞在不同平面反复分裂，形成孢囊孢子.有的孢囊孢子可以丛毛运动 横隔孢子基内菌丝或气生菌丝横隔分裂形成，孢子常为球杆状，体积大小相似，又称节孢子或粉孢子。 孢子——形态：有圆、卵圆、柱状等。 表面：或光滑或粗糙；有的还带有毛刺、鞭毛。 ——色素：因种而异。 二、放线菌的繁殖 根据电镜观察结果，放线菌孢子形成是以横隔分裂方式进行的。横隔分裂可以通过两种途径实现： 1.         细胞膜内陷，并由外向内逐渐收缩，最后形成一个完整的横割膜。通过这种方式可把孢子丝分割成许多分生孢子； 2.         细胞壁和细胞膜同时内陷，并逐步向内缢缩，最终将孢子丝缢裂成一串分生孢子。 （孢子的形状多样，有球形、椭圆状、杆状、圆柱状、瓜子状、梭状和半月状等。孢子的颜色丰富，且与其表面纹饰有关。孢子表面的纹饰在电子显微镜下清晰可见，出表面光滑者外，还有皱褶状、疣状、刺状、发状和鳞片状；刺有粗细、大小、长短和疏密之分。一般直形和波曲的孢子丝都产生光滑的孢子，螺旋状孢子丝产生的孢子表面结构因种而异） 放线菌孢子特点：对干燥抵抗力强，对热抵抗性不强。多为 65℃，10～15min失活（嗜热放线菌例外）。

放线菌的生活史 芩沛森—公微—62 以链霉菌为例。

支原体形态（丝状支原体的电镜照片，注意球状和丝状体）

从热泉中分离的火山热原体细胞电镜照片（投影技术）

深层地表中的产甲烷菌

三角形和方形古生菌

隐蔽热网菌 a）暗视野下的形态；b）电镜超薄切片。该菌不同细胞的直径差异范围可达0.3 - 2.5 mm

不规则形状的古生菌

细菌细胞的大小 微生物个体大小衡量单位 细胞 mm （=10-6 m） 病毒 mm （=10-9 m） 大小范围 最小： 与无细胞结构的病毒相仿（50 nm；） 最大： 肉眼可见（0.75 mm）；

费氏刺骨鱼菌 (0.08 mm x 0.6 mm) (Epulopiscium fishelsoni) 比大肠杆菌大100万倍 （1985年发现）

Thiomargarita namibiensis，---------“纳米比亚硫磺珍珠” 德国科学家H. N. Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中 发现的一种硫磺细菌（sulfur bacterium），其大小可达0.75 mm， Thiomargarita namibiensis，---------“纳米比亚硫磺珍珠”

最大和最小细菌的个体大小悬殊： 15000倍 （Thiomargarita namibiensis）（0.75mm） （nanobacteria）（50 nm）

不同细菌大小比较

细菌大小测量结果的影响因素 个体差异； 干燥、固定后的菌体会一般由于脱水而比活菌体缩短1/3-1/4； 染色方法的影响，一般用负染色法观察的菌体较大； 幼龄细菌一般比成熟的或老龄的细菌大； 环境条件，如培养基中渗透压的改变也会导致细胞大小的变化。

二、真菌 真核生物： 是一大类细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的生物称真核生物。 真核生物： 是一大类细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的生物称真核生物。 真核生物的特征： 细胞核有核膜；细胞质中有多种细胞器；能进行有丝分裂。微生物中的真核生物，即为真核微生物 即具有上述特征的微小生物

单细胞真菌－ 酵母菌 真菌 假菌 粘菌 丝状真菌－霉菌 菌物界 大型真菌－蕈菌

1、 丝状真菌——霉菌 ⑴、分布及与人类的关系 1、 丝状真菌——霉菌 霉菌（mold）是丝状真菌的一个俗称，通常指那些菌丝体较为发达又不产生大型肉质子实体结构的真菌。 ⑴、分布及与人类的关系 ①工业上的有机酸、酶制剂抗生素、维生素、生物碱等 的发酵生产 ②进行生物防治，污水处理和生物测定 ③食品制造方面，如酱油的酿造和干酪的制造　 ④在基础理论研究方面，霉菌是良好的实验材料

2、霉菌的形态结构 霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝（hyphae)构成。菌丝是真菌营养体的基本单位。 菌丝是中空管状结构，直径一般3～10μm，有分枝，有隔膜或无隔膜。 根据菌丝有无隔膜，可以将真菌分成低等真菌（鞭毛菌亚门和接合菌亚门）和高等真菌（子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门）两大类。 许多菌丝分枝连接，相互交织在一起所构成的形态称菌丝体（mycelium)。 （一）菌丝 定义：真菌营养体的基本单位是菌丝（hyphae）。 形态：菌丝直径一般3～10μm，有分枝，有隔膜或无隔膜，根据菌丝有无隔膜，可以将真菌分成低等真菌（鞭毛菌亚门和接合菌亚门）和高等真菌（子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门）两大类。 图——28霉菌菌丝图 Their basic cellular unit is described as a hypha. This is usually a tubular cell which is surrounded by a rigid, chitin-containing cell wall. The hypha extends by tip growth, and multiplies by branching, creating a fine network called a mycelium. Hyphae contain nuclei, mitochondria, ribosomes, Golgi and membrane-bound vesicles within a plasma-membrane bound cytoplasm. The sub-cellular structures are supported and organized by micro-tubules and endoplasmic reticulum. If you have forgotten what these structures look like and what they do, please check them in a basic text book. Not all fungi are multicellular, some are unicellular and are termed yeasts. These grow by binary fission or budding, creating new individuals from the parent cell. Simplified diagram of a vegetative yeast cell and a budding cell:

菌丝体及其各种分化形式 由许多菌丝相互交织而成的一个菌丝集团称菌丝体 营养菌丝体——密布在固体营养基质内部，主要 执行吸收营养物功能的菌丝体 气生菌丝体——伸展到空间的菌丝体 这两类菌丝体在长期的进化中，因其自身的生理功能和对不同环境的高度适应，已明显地发展出各种特化的构造。

营养菌丝体的特化形态 （1）假根：是Rhizopus(根霉属)等低等真菌匍匐菌丝与固体 基质接触处分化出来的根状结构，具有固着和、 吸取养料等功能。 （2）匍匐菌丝：毛霉目真菌在固体基质上常形成与表面平 行、具有延伸功能的菌丝，又称匍匐枝。

b）产黄青霉 c）黄曲霉的分生孢子形态电镜照片

A 酿酒酵母 B 路德酵母 C 白地霉 D 膜醭毕赤酵母

a）微星鼓藻属，单细胞；b）团藻属，由很多单细胞组成的群体；c）栅藻属，四个细胞组成的栅状 d）水棉属，一种丝状藻类，注意其螺旋状的叶绿体。

光学显微镜下的原生动物。 a）阿米巴（Amoeba）；b）纤毛（Paramecium）；c）鞭毛虫（Dunaliella）；d）间日疟原虫

思考题 1 一般说来，严格的无菌操作是一切微生物工作的基本要求，但在分离与培养极端嗜盐菌时常在没有点酒精灯的普通实验台上倾倒培养平板、在日常环境中直接打开皿盖观察和挑取菌落，而其研究结果并没有因此受到影响，你知道这是为什么吗？ 2 如果希望从环境中分离得到厌氧固氮菌，你该如何设计实验 3 为什么光学显微镜的目镜通常都是15×？是否可以采用更大放大倍率的目镜（如30×）来进一步提高显微镜的总放大倍数？ 4 为什么透射电镜和扫描电镜对样品厚度与大小的要求有如此大的差异？能否用扫描电镜来观察样品的内部结构，而用透射电镜来观察样品的表面结构？ 5 试论电子显微镜在进行生物样品制备与观察时应注意的问题 6 培养条件对微生物个体的大小有那些影响？你是否能很快地在显微镜下区分同为单细胞的细菌、酵母菌、和原生动物？

1、为什么说Koch等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？ 2、微生物的最显著特征就是个体微小，通常只能通过显微镜进行观察。试列举在显微观察中（光镜和电镜）通过改变 样品的反差以改善观察效果的技术及方法。 3、试利用表格形式对各类显微镜在原理、样品制备和观察方 面的异、同进行概括、比较。 4、 试找到一篇使用微生物照片的文献，分析该文为什么要使 用微生物照片，采用的是何种显微观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪些技术获得？

再 见