疫苗制造基本程序 葛俊伟

内容 项目一 细菌性灭活疫苗制造 项目二 细菌性活疫苗制造 项目三 病毒疫苗的制造

项目一 细菌性灭活疫苗制造

灭活细菌疫苗通用制造程序 菌种的选择 菌液培养 灭活 配苗 浓缩 一、细菌性灭活疫苗制造 细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多， 菌种的选择 菌液培养 灭活 配苗 浓缩 细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多， 但制造的基本程序差别不大。 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗

基本流程 菌液 灭活 原料 灭活菌液 佐剂 配置 + 乳 化 分装和保存

一、细菌性灭活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （一）菌种与种子 1.菌种 制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。 各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。 2.种子培养 将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。 种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。

一、细菌性灭活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （二）菌液培养 大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。 机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。 菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所以比较适用于制备诊断用的抗原。

一、细菌性灭活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （三）灭 活 灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表所示。 表 几种灭活菌苗的灭活方法

一、细菌性灭活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （四）浓 缩 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。 常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法 离心沉降法 羧甲基纤维沉淀法 以上方法可使菌液浓缩一倍以上。 此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸—食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。

一、细菌性灭活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （五）配苗与分装 由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。 氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。 有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、 11.4m1Span-85、3.6ml Tween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。 配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。

项目二 细菌性活疫苗制造

二、细菌性活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 浓缩 配苗 （一）菌种与种子 细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。 弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。 菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。 将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。 种子液通常在0～4C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。

二、细菌性活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 浓缩 配苗 （二）菌液培养 按1%～3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。 如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液 如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液 菌液于0～4C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格后使用。

二、细菌性活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 浓缩 配苗 （三）浓缩 （四）配苗与冻干 为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2% ～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。 （四）配苗与冻干 经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。 分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。

流程图1——细菌疫苗制造工艺流程 蛋白质、肉浸液等原料 培养基 细菌分离 菌 种 弱毒菌种 配置、灭菌 鉴定 减毒 检验 配制 灭菌 原 料 原 料 佐 剂 灭活菌液 配苗、乳化 灭活疫苗 培 养 菌苗原液 配 苗 活疫苗 保护剂 菌 液 分装、冻干 分 装 灭活 活化 种子

项目三 病毒疫苗制造 病毒性禽胚培养疫苗制造 病毒性细胞培养疫苗制造 病毒性动物组织疫苗制造

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （一）鸡胚选择 痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，目前仍然利用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟热鸡胚弱毒疫苗等。 禽胚疫苗生产的原材料来源方便、质量比较容易控制，制造程序简单，不需要过高的设备条件，生产的疫苗质量可靠。 （一）鸡胚选择 受精卵应来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。 从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接毒培养。

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （二）种毒与毒种继代 目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存，保存的种毒多为冻干毒。 冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作力生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的检定等。

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （三）接毒与收获 1.接毒 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。 接种途径：绒毛尿囊膜接种 11~12日龄胚 尿囊腔接种 9~11日龄胚 羊膜腔接种 10~12日龄胚 卵黄囊接种 5~8日龄胚 如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3稀释毒种0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。

也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。 2.培养收获 鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。 如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相对湿度60%~70%条件培养增殖，收集接毒后24~48h内死亡胚，置0~10C冷却4~24h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿苗用。 也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。 鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48~120h内死亡的鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （四）配 苗 按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。 1.湿苗 通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素500~1000U，放置0~10C 冷暗处处理后分装。 2.冻干苗 经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素500~1000U，混合后分装冻干。 3.灭活苗 收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液，按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫苗，放置4-10C保存。

流程图2——病毒性禽胚疫苗制造工艺流程 受精卵 毒 株 培育 鉴定 接种 禽 胚 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒尿囊液或禽胚组织 毒 株 培育 鉴定 接种 禽 胚 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒尿囊液或禽胚组织 含病毒悬液 原 料 原 料 灭活 配制 纯化病毒悬液 灭活病毒液 配制 保护剂 配 苗 配苗、乳化 佐 剂 分装、冻干 分 装 检验 检验 活疫苗 灭活疫苗

二、病毒性细胞培养疫苗制造 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 （一）种毒与毒种继代 细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细胞及细胞培养方法也有所不同 （一）种毒与毒种继代 用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门检定分发。 领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种，制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种，或为冻干毒种。

二、病毒性细胞培养疫苗制造 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 （三）细胞制备 制造疫苗用的细胞大体为原代细胞和传代细胞两类，根据病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不同的细胞。 选择的依据包括：病毒的适应性高、毒价高、细胞来源方便、制备简单、生命力强。 如猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞疫苗采用犊牛睾丸原代细胞；脊髓灰质炎活疫苗选择vero细胞；狂犬病弱毒细胞适应疫苗采取BHK21细胞增殖病毒等。 培养细胞和增殖病毒用的营养液又称培养液，通常分为细胞培养用的生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的之处通常只是生长液内含有5%-10%的血清；维持液血清浓度为2%-5%。 不同细胞所需的营养成分和生长条件不尽相同。 目前常用的细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和悬浮培养在我国尚处于试验之中。

二、病毒性细胞培养疫苗制造 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 （四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%-2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现70%-85%以上细胞病变时即可收获。 病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后供配苗用。

二、病毒性细胞培养疫苗制造 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 （五）配 苗 1．灭活疫苗 不同灭活剂对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。 2．冻干苗 细胞毒液内按比例加入保护剂或稳定剂，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。

流程图3——病毒性细胞疫苗制造工艺流程 动物或胚胎 毒 株 组 织 原 料 培育 鉴定 配制 剪碎 消化 种 毒 细胞悬液 细胞培养液 扩增 毒 株 组 织 原 料 培育 鉴定 配制 剪碎 消化 种 毒 细胞悬液 细胞培养液 扩增 鉴定 种 子 生长细胞 传代细胞 原 料 培养 收获 原 料 原 苗 灭活病毒 配制 灭菌 灭活 配制 配 苗 （混匀、乳化） 保护剂 配 苗 佐 剂 分装、冻干 分 装 检验 检验 活疫苗 灭活疫苗

三、病毒性动物组织疫苗制造 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 （一）动物选择 病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗称为组织疫苗(tissue vaccine)。 动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。 （一）动物选择 动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用，动物必须符合下列标准： (1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性病原体动物； (2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面合乎要求的实验动物。

三、病毒性动物组织疫苗制造 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 （二）种毒与接种 种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器组织毒或强毒株增殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和免疫原性检查合格后使用。 接种途径依病毒性质和目的而异，例如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内途径感染。 几种动物常用的接种途径如下： 1. 脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。 2. 静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。 3. 肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。 4. 皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。 5. 腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。

三、病毒性动物组织疫苗制造 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 （三）观察与收获 动物在接种感染后应每天观察和检查规定的各项指标，指标或项目因不同病毒而异。常规观察、检查的项目如食欲、精神和活动状态、体温、粪便、尿和血液变化等。 根据观察的征象和检查的结果选出符合要求的发病动物按规定方式剖杀，采取收集含毒量高的器官组织。如猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备；兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产；狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。

三、病毒性动物组织疫苗制造 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 （四）制 苗 1．组织灭活疫苗 （四）制 苗 1．组织灭活疫苗 采取收获的组织经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液和灭活剂（甲醛、酚、结晶紫等）制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。如狂犬病疫苗配制按脑组织1:4加入含有甘油及1%酚蒸馏水，于360.5C灭活7天制成；猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份，结晶紫甘油溶液1份混合，于37C~38C灭活6~8天。 2. 弱毒组织疫苗 在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，称重后剪碎，加入适最保护剂制成匀浆，然后滤过扣除残渣量，再按滤液中的实际组织量计算稀释倍数，加入余量保护剂和青链霉素500~1000U(g/ml)，充分摇匀后置0~4C冷暗处处理一定时间后作无菌检验与毒价测定。合格者进行分装，冷冻真空干燥制成冻干疫苗。

流程图2——病毒性组织疫苗制造工艺流程 动 物 毒 株 培育 鉴定 接种 感染动物 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒组织 含病毒悬液 毒 株 培育 鉴定 接种 感染动物 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒组织 含病毒悬液 原 料 原 料 灭活 配制 纯化病毒悬液 灭活病毒液 配制 保护剂 配 苗 配苗、乳化 佐 剂 分装、冻干 分 装 检验 检验 活疫苗 灭活疫苗

影响疫苗质量的因素 毒种：毒种的优劣不仅影响疫苗的产量，而且也影响疫苗的质量，毒种不纯会产生相互干扰，减毒活疫苗毒种若毒力回升易造成事故，因此毒种的选择应挑选那些致病性低，免疫效价高而持久，抗原谱广的，易增殖，便于生产，可在传代细胞上传代的毒种。 培养病毒的细胞：细胞若有潜在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。对此因素应严格检查。此外若细胞本身发生转化后，不宜于制备活疫苗，只能制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。 培养液：培养细胞的营养液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常会出现某种程度的过敏反应，为此，应尽量使细胞适应于无血清蛋白的培养基中，以消除过敏源。 甲醛灭活剂的使用：甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗原性，因此普遍用来制备灭活病毒疫苗，但要控制含量。

获得质量优良、安全的产品，关键环节如下 1. 选择优良的菌种和毒种，并保持其稳定性； 2. 选用适当的培养繁殖细菌与病毒等微生物的方法，包括优良的培养基、合乎要求的最好是标准化的实验动物、禽胚及细胞； 3. 熟练掌握制品的生产工艺； 4. 准确掌握产品的检验方法和判定标准，严格按标准进行质量检定。