第二篇 动物细胞工程

问题讨论 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？ 取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植

第四章 细 胞 培 养

http://ask.bbioo.com/special/experiment/cellculture.htm

动物细胞与组织培养 从动物体内取出组织或细胞，模拟体积内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。

细胞培养的优点 1.活细胞： 能长时间、直接观察、研究 活细胞的形态、结构、生命活动 2.可控制： 1.活细胞： 能长时间、直接观察、研究 活细胞的形态、结构、生命活动 2.可控制： 可控制-选择对象：均一性、重复性 哪一种：类型：上皮？间质？------ 性质：正常？肿瘤？------ 阶段： 可控制-调节条件：各种因素 物理、化学、生物等因素

可控制-利用方法： 采用各种研究技术、记录方法： 研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、 电子显微镜、流式细胞术、激光共焦 显微镜、免疫组织化学、原位杂交、 同位素标记-- 记录：摄影照片、缩时电影、电视------

3.应用广： 对象广： 各种动物：低等动物--高等动物--人类 一种动物：不同年龄-- 不同组织-- 正常或异常（肿瘤--） 4.较经济： 可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似 的实验对象

细胞培养的缺点 现人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同. 当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化.

1.与体内主要不同 相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的影响

2.主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化； 3.提示 要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。

细胞培养的基本知识 4.1 培养细胞的特性 4.1.1 体外培养细胞的分型 贴附型细胞： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮型细胞：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。

大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依 赖性细胞，大致分成以下四型： 成纤维细胞 上皮型细胞 游走细胞型 多型细胞型

1、成纤维细胞型 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 　　　真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 　　　血管内皮 形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等 的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维 样细胞，常有几个伸长的细胞突起

成纤维细胞

HUVECs人脐静脉内皮细胞 1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞； 2.培养的天数：4d；原代培养； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：DMEM+15％胎牛 血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。 骨髓间充质干细胞 1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代； 2.培养天数：7天； 3.放大倍数：200倍，倒置显微镜； 4.培养基种类：DF12+10％FBS； 5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。

2、上皮型细胞 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆 　　　形核 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状 　　　生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动

上皮型细胞

CCL-149 1.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞； 2.培养的天数：1d（种在48孔板中）； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，3－4天传代一次，Giemsa染色。 SKOv3 （卵巢癌细胞） 1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞） 2.培养的天数：传代后3d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。

3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 　　呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 CNE1 1.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系； 2.培养的天数：3d； 3.放大倍速：相差100； 4.培养基种类：PMI1640+10%CS； 5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞， 梭型成团生长。

4、多型细胞型 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 SD大鼠神经元 原代 1.细胞种类：脑皮质细胞； 2.培养的天数：4-5天； 3.放大倍速：电镜　20000； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10%马 血清； 5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴 突和树突。

细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板 贴附生长型细胞

+ + + + + + + + + + + + 贴附物质带正电荷 细胞带负电荷 细胞的贴附过程

成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起 上皮细胞：扁平、多角形、园核 可连成单层

悬浮型 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 　　　易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细 　　　胞)

悬浮生长型细胞

HL-60 分化细胞Giemsa染色 1. 细胞种类：HL-60； 2. 培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天； 3. 放大倍速：倒置显微镜 X10； 4. 培养基种类：1640+8％胎牛血清； 5. 细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。

KU812 1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系； 2.培养的天数：5d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。

HeLa细胞 1. 细胞种类：人HeLa细胞传代培养； 2. 培养的天数：7d； 3. 放大倍速：倒置显微镜 X200； 4 HeLa细胞 1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养； 2.培养的天数：7d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X200； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。

K562细胞 1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）； 2.培养的天数：传代后2天； 3.放大倍数：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine； 5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。

4.1.2 培养细胞的生长特点： a.贴附 贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长。 b. 接触抑制 c. 密度依赖性

4.1.3 培养细胞的生长与增殖过程 细胞系的生长过程 每代细胞的生长过程 单个细胞的生长过程

G1期（ DNA合成前期） 间期 S期（ DNA合成期 ） G2期（ DNA合成后期） 细胞周期 M期（有丝分裂期）

原代培养 用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。

传代细胞培养 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。

细胞系 培养物开始第一次传代培养后的细胞 有限细胞系（Finite Cell Line） 连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line） 肿瘤细胞系或株 我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞 具有不死性和异体接种致瘤性。

细胞株 用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。

细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种至两个或者更多的培养器皿中(数天到一周左右) 4.1.3.2 细胞系的生长过程(三个阶段)： a.原代培养或初代培养期 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养(1-4周) b.传代期 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种至两个或者更多的培养器皿中(数天到一周左右) c.衰退期 在此期间细胞开始时虽仍然存活，但生殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡(传代30-50次以后)

细胞系的生长过程 为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。 原代培养期 为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。 原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时，便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。 传代期 一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。 衰退期

消化传代的步骤

(3) 每代细胞的生长过程 a. 潜伏期 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮态，也称为悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min-4h b.指数生长期： 又称对数期。此期间细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞生长增殖状况可以依据细胞倍增情况(细胞群体倍增时间)及细胞分裂指数等来判断。(3-5天)

c.生长停止期(平台期)： 此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。

P42 4.1.4 培养细胞的遗传学特性 4.1.5 体内外细胞的差异及培养细胞的分化

4.2 细胞培养液 4.2.1 细胞培养常用的液体

动物细胞培养用液的配制 1、 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2、平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml

3、消化液： （1）胰蛋白酶溶液 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用

(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 。 (3)胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。

4、消化酶抑制剂 无血清时必须使用消化酶抑制剂，保护细胞免受残留的消化酶的过度消化而损坏。 5、pH调整液 常用的有NaHCO3溶液和HEPES溶液

6、抗生素 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 7、谷氨酰胺补充液

4.2.2 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 4.2.2 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物 的提取和实验结果分析。易发生支原体污染

血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分

何谓FBS、FCS、 CS、HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。 CS (calf serum) 则是指小牛血清 HS (horse serum) 则是指马血清

牛血清 胎牛血清应取自剖腹产的胎牛 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛 小牛血清取自出生10－30天的小牛 使用浓度： 一般为5－20％，最常用是10％

血清的使用 血清质量好坏是实验成败的关键 常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 血清的消毒 过滤除菌。

一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死。但支持细胞生长一般需加 10％血清。 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．

无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。

向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 。

合成培养基: 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长 需要。

RPMI-1640 最初是由G，E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。 开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。 其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。 尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、 K-562 及KATO—III等细胞系的培养。

RPMI1640种类 RPMI—1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌） RPMI—1640（A）无酚红 （不含谷氨酰胺、高压灭菌） （含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）

DMEM细胞培养基 是在MEM培养基的基础上研制的 与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。 高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。  DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】  DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】  DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。

干粉培养基的配制 认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 所用器皿应严格消毒。 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

完全培养基的组成 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位／毫升

培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％）

培养细胞生长的条件 细胞的生存环境 a.温度: 适宜的温度与取材的动物种类有关 b.气相及pH: 一般气体环境为95%空气加CO2的混合气体。 pH: 7.2-7.4 CO2为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的pH有关， CO2增加将使pH下降。 CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-

渗透压：因细胞的类型及种族而异。由于人类血浆的渗透压约为290m mol/L，因此认为这是体外培养人类细胞的理想渗透压。 无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须条件。凡与细胞直接接触者(如培养瓶、底物、培养剂等)或间接接触者(如瓶盖瓶塞等)，若具细胞毒性，都会导致细胞的死亡。污染问题包括细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及上述有害物质的污染。

细胞培养介绍

细胞培养室的设备和准备工作 1 设备： 超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜 干燥箱，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪，压力蒸汽消毒器，滤器 离心机及天平 冰箱，细胞冷冻存储器(液氮容器或低温冰箱) 常用培养器皿：培养瓶，培养皿，多孔培养板，吸管，加样器 其它用品：离心管，冻存管，酸缸，烧杯，注射器，量筒等 NEXT

超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒。 ③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。

2 培养用品的清洗消毒灭菌 玻璃：浸泡→刷洗(洗洁精)→烘干→酸泡(24h )→流 水、单蒸双蒸分别冲洗→烘干 塑料： a.滤器和注射器：清水、单双蒸各超15min→烘干 b.多孔培养板： c.胶塞，瓶盖等：流水、单蒸双蒸分别冲洗→烘干 →用双蒸水煮沸30min →烘干 消毒灭菌：高温湿热灭菌 玻璃：121 ℃，30min 塑料：115 ℃，15min(多孔板用紫外照射) NEXT

洗液的配制

4.3 细胞的基本培养技术

基本概念 细胞系 细胞株 原代培养 传代

细胞系或细胞株的命名 以供体患者的姓名命名： HeLa （来源于宫颈癌） 以时间地点来命名： 以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞) CHO 中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese Hamster Ovary， ） 宫-743： 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立 每3天传代，每次接种3×105细胞／ml 以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞) 以临床疾病类型命名： 如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞)

原代培养 直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。 优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。 大鼠肝细胞原代培养 1.细胞种类：大鼠原代肝细胞； 2.培养的天数：刚分离，未经培养； 细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁 后呈不规则。

取材 鸡胚组织 鼠胚组织 皮肤和黏膜 血细胞 内脏和实体瘤

组织细胞分离 机械法 离心分离法、切割分离法、机械分散法 消化法 胰蛋白酶 0.25% pH=7.2 胶原酶 螯合剂 P54 表4.5

方法与步骤

方法与步骤 （1）动物处死：将小鼠用拉颈椎方法处死。背部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腰部两侧被毛。 （2）取组织：在无菌条件下将肾脏取出，置于无菌培养皿中，剪去肾膜和脂肪，用Hanks液洗涤1次；放入另一培养皿中，纵向剪开肾脏，去掉肾盂，将肾剪成1mm3大小的块，再并用Hanks液洗涤2～3次，直到液体澄清。

（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌青霉素瓶内，加入5～6倍量的0. 25％胰蛋白酶液（pH7. 4 ～ 7 （3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌青霉素瓶内，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4 ～ 7.6），置37℃水浴中消化20 ～ 40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出青霉素瓶，在超净台中吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。

（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 ～50万个细胞为宜。 （5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，在培养瓶上做好标记，置于37℃的CO2培养箱中培养。 （6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。

动物细胞原代培养过程图

传代 将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。 HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞； 培养的天数：传代培养2天； 细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。

传代细胞密度不低于 5×105个/ml 传代2h后，观察细胞贴壁情况并记录。 贴壁率 25% + 50% ++ 75% +++ 准备传代。

细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

方法与步骤 （一）贴壁细胞传代培养 （1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。 （2）加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，37 ℃消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。 （3）用Hanks液洗涤1次，加入1～2滴管培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。 （5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

（二）悬液细胞的传代培养 （1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。 （2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1 000r/min）5min。 （3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。 （5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。

传代注意事项 接种数量为5×104～8×105个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。

细胞计数 计数结果以每毫升细胞数表示 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数

细胞计数步骤 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。　 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。 　　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104 注意：压线细胞只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

培养细胞活力测定 细胞活力： 总细胞中活细胞所占的百分比 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。 复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

测定方法 台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。 流式细胞仪 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。

四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢 （formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值；

细胞的同步培养 选择细胞同步化 诱导细胞同步化

细胞冻存和复苏 细胞深低温保存的基本原理是： 在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 细胞低温保存的关键： 在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

冻存和复苏的原则：慢冻快融 慢冻程序 4 ℃ 10 分钟 －20 ℃ 30 分钟 －80 ℃ 16 - 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存。

细胞复苏方法 （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ 38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。 也有用甘油的 冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO（或10％甘油） DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。

细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？ 冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml 为宜。

细胞培养的污染和检测 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞

细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。

白色念珠菌污染

真菌感染

支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状

细菌和真菌的污染和检测 肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法

支原体的污染和检测 Hayflick培养基直接培养法 DNA荧光染色法 PCR方法 相差显微镜观察法 测出细胞株有支原体污染时， 应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

病毒的污染和检测 细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 免疫学检查 PCR技术

细胞培养条件要求 无菌条件 细胞生长条件 细胞检测条件 细胞保存条件 实验室安全

细胞培养的无菌环境 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 （使用前）紫外照射（1小时） 每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒

生物安全柜 使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟， 预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。 使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。 还要定期用福尔马林熏蒸。

常用培养器皿及清洗消毒 玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

消毒前包装 常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔

火焰消毒 在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 培养瓶 滴管、试管、吸管

细胞培养的实验用品 细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈 25平方厘米，三角斜颈 75平方厘米，正方斜颈 75平方厘米，三角斜颈 150平方厘米，正方斜颈

细胞培养板  6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔

细胞培养皿  35mm  60mm  100mm 

冻存管 1.2ml 2ml， 5ml

离心管  15ml  50ml 细胞刮

滤 器 大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

液氮罐

何处购买细胞 ATCC 细胞库(www.atcc.org). 目前它可以提供以下物品 细胞系3000种 细菌和噬菌体 15000种 动植物病毒 2500种 原生动物 1200种以及重组物品 欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB)

国内细胞库 中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 联系方法： 地址：上海市岳阳路320号，200031 电话：021-54920404， 54920405 Fax: 021-54920406 联系人：陈松华，徐惠均 e-mail: shchen@sibs.ac.cn

http://sub.whu.edu.cn/cctcc/fzlbc/pywml.htm 中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料／菌种保藏机构

订购程序 向中心订购培养物（可查阅CCTCC培养物目录，并向CCTCC提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容） 联系方式可通过电话、传真，信函，电子邮件等方式。 电话：027-87682319 传真：027-87883833 E-mail:cctcc@whu.edu.cn 细胞系：300～500元/每株 菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。

动物细胞培养

动物细胞培养 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 胰蛋白酶 细胞悬浮液 单个细胞 剪碎 细胞增殖 部分细胞无限传代 动物细胞培养不能 加培养液 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 胰蛋白酶 细胞悬浮液 单个细胞 剪碎 制成 去掉组织间蛋白 细胞增殖 部分细胞无限传代 原代培养 传代培养 动物细胞培养不能 最终培养成生物体

动物细胞培养条件： 1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） 保证细胞顺利的生长增殖