华中科技大学同济医学院心血管病研究所 附属协和医院心内科 生物靶向治疗教育部重点实验室 廖玉华 高血压防治的新视野 ——炎症免疫与高血压 华中科技大学同济医学院心血管病研究所 附属协和医院心内科 生物靶向治疗教育部重点实验室 廖玉华 ICUH Institute of Cardiology Union Hospital 中部心脏病学会议2013 武汉

迫切需要寻找高血压的新型治疗技术 全球高血压患病率高,控制率低,依从性差 高血压已成为全球重大公共卫生问题，预计到2025年，高血压患病率将增至29.2% 目前中国高血压患病人数估计2.3亿，2010年中国高血压控制率9.5% 高血压可由多因素引发，其中肾素-血管紧张素系统(RAS)在高血压发生发展过程中发挥关键作用，针对RAS降压药物具有良好的疗效，减少CVD事件 全球降压治疗依从性差和控制率低，亟待寻求新的治疗方案 2010年中国高血压防治指南

1. 高血压免疫机制与针对性治疗 2. 治疗性降压疫苗研究进展

高血压患者存在慢性炎症的证据 高血压患者血浆和高血压动物模型组织高表达炎症因子，如CRP、IL-6、IL-1、TNF-α、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1 原发性高血压患者血清存在抗α1-受体抗体、抗AT1-受体抗体和抗钙通道抗体 高血压患者和高血压动物模型中存在异常激活的单核/巨噬细胞和T细胞 Fichtlscherer S, et al. Circulation. 2000;102:1000-1006 Sesso HD, et al. JAMA 2003; 290: 2945-2951 Liao YH, et al. Hypertension Research. 2002;25:641-644 Liao YH, et al. Chin Med J (Engl). 2008;121(16):1513-7 Yanagitani Y, et al. Hypertension. 1999;33(1 Pt 2):335-9 Hilgers KF. J Hypertens. 2002;20(4):593-6 Minagawa M, et al. Cell Immunol. 1999;196:1-13

20525例血压正常女性经过平均7.8年随访 高CRP水平者有着更高的高血压发病率 Sesso HD, et al. JAMA 2003; 290: 2945–2951

高血压患者血浆Ab、RAAS和CA的水平 慢性疾病与疫苗 高血压患者血浆Ab、RAAS和CA的水平 RHT group n=98 NRH group n=96 Male/female 57/41 57/39 Age(years old) 54.5±11.2* 54.8±10.5 Ab –AT1 -receptor n(%) 42(42.86%)*** 10(10.42%) Ab -α1- receptor n(%) 36(36.73%)*** 13(13.54%) PRA(nmol/L.h.) 0.61±0.60*** 0.39±0.39 Ang Ⅱ (pmol/L) 0.46±0.20*** 0.36±0.11 Ald(pmol/L) Norepinephrine(nmol/L) 1.81±0.82** 1.59±0.70 Adrenamine (nmol/L) 2.37±1.08** 1.90±1.17 *p>0.05，**p<0.05， ***p<0.001 Liao YH, et al. Hypertens Research, 2002; 25:641-644

免疫机制参与高血压的血管重构 抗α1-受体抗体和抗AT1受体抗体介导血管重塑 α1-受体肽段免疫大鼠1年 动脉病理改变 *p<0.01 AT-受体肽段免疫大鼠1年 动脉病理改变 体外实验：抗α1-受体抗体和抗AT1受体抗体具有激动剂效应 Zhou ZH, et al. Clinical Immunology. 2005;114:164-173 Wang B, et al. Heart and Vessel, 2005;20(4):153-8

抗α1-受体抗体和抗AT1受体抗体增加 高血压脑卒中复发和死亡（随访3.3年） anti-α1R-Ab anti-AT1-Ab 复 发 率 死 亡 率 *compared with negative group, *P<0.05 Liao Yuhua,et al. Circulation 2005, (Abstract Supplement):II-346 Zhou Zihua,et al. Eur J Heart，2005;26(Abstract Supplement):750.

不同炎症细胞在肾血管性高血压大鼠 心肌内小动脉的聚集（选择1个月标本） 为什么高血压患者会产生抗血管受体自身抗体？ ED1+巨噬细胞 CD4+淋巴细胞 CD8+淋巴细胞 CD4+T细胞 Th2 细胞 记忆性 B细胞 浆细胞 Anti-ATR抗体 ATR、抗原 DC Nicoletti et al. Cardiovascular Research. 1996;31:585-595

高血压的神经-体液-免疫发病机制 抗血管受体抗体是高血压发展中的产物 下丘脑中枢 脑室周围器官-血脑屏障，产生ROS 脑干中枢 体液免疫 最后区 下穹窿器官 下丘脑中枢 脑干中枢 孤束核 腹侧髓质 室旁核 神经支配Innervation ,明显的overt,高血压的发生首先是血管紧张素Ⅱ、盐和慢性应激等刺激因素作用于中枢神经系统，增加交感神经传出。脑室周围器官(CVO)包括下穹窿器官(SFO)、媒介视交叉前突起(MPO)的终板血管器（OVLT）和最后区(AP)具有一个薄弱血脑屏障形成，对血液循环的血管紧张素Ⅱ和钠很敏感。这些刺激增加了CVO的ROS产生，传入下丘脑中枢包括室旁核（PVN），小神经胶质细胞被激活，增加冲动传入脑干中枢，包括腹侧髓质(VLM)和孤束核(NTS)。 体液免疫 抗血管受体抗体 Harrison DG. Front Physiol. 2012;3:128. doi: 10.3389/fphys.

坎地沙坦西酯与咪哒普利阶梯治疗高血压: 一项随机研究评价抗AT1受体抗体的作用 Wei F,et al. Heart 2011;97:479e484

方法 阶梯治疗方案 目标: BP﹤140/90mmHg SOT-AT1研究 入选 3 周 5 周 7 周 8 周 坎地沙坦治疗组 咪达普利5mg/d 入选 坎地沙坦8mg/d 坎地沙坦 8mg/d+DHCT 12.5mg/d 坎地沙坦8mg/d + DHCT 12.5mg/d + 非洛地平 5mg/d 坎地沙坦 8mg/d + DHCT 12.5mg/d + 非洛地平 5mg/d + 美托洛尔 50-100mg/d 咪达普利5mg/d+DHCT 12.5mg/d 咪达普利5mg/d + DHCT 12.5mg/d + 非洛地平 5mg/d 咪达普利5mg/d + DHCT 12.5mg/d + 非洛地平 5mg/d + 美托洛尔 50-100mg/d 3 周 5 周 7 周 目标: BP﹤140/90mmHg 8 周 坎地沙坦治疗组 咪达普利治疗组 Wei F,et al. Heart 2011;97:479e484

按照抗AT1受体抗体分层分析  ITT人群中血压变化 SOT-AT1 研究 血压下降差值 (mmHg) 抗AT1-受体抗体阳性组 坎地沙坦 咪达普利 抗AT1-受体抗体阳性组 抗AT1-受体抗体阴性组 SBP DBP -6mmHg p=0.000 -2.8mmHg p=0.002 -1.8mmHg p=0.156 -0.6mmHg p=0.507 Wei F,et al. Heart 2011;97:479e484

按照抗AT1受体抗体分层分析  PP人群中血压变化 SOT-AT1 研究 血压下降差值 (mmHg) 抗AT1-受体抗体阳性组 坎地沙坦 咪达普利 抗AT1-受体抗体阳性组 抗AT1-受体抗体阴性组 SBP DBP -6mmHg p=0.000 -3.1mmHg p=0.001 -2.1mmHg p=0.094 -1.1mmHg p=0.231 Wei F,et al. Heart 2011;97:479e484

其他结果 抗AT1受体抗体阳性高血压患者两治疗组联合用药情况 SOT-AT1 研究 坎地沙坦 咪达普利 为达目标血压，抗AT1受体抗体阳性咪达普利治疗组患者联合用药情况显著高于坎地沙坦治疗组 (P＝0.03) 咪达普利 单一药物治疗 联合用药 Wei F,et al. Heart 2011;97:479e484

SOT-AT1研究的意义：针对性降压治疗 SOT-AT1研究证明：针对致高血压的抗AT1受体抗体阳性患者，选择ARB治疗，降压疗效更好，为高血压个体化治疗提供了新理论和新方法 如果采用随机双盲平行对照临床试验，其结果更有价值 如何提高高血压控制率：针对性降压治疗是解决高血压控制率低行之有效的方法 Wei F,et al. Heart 2011;97:479e484

1. 高血压免疫机制与针对性治疗 2. 治疗性降压疫苗研究进展

History of Renin-Angiotension System Vaccines Chemical Drugs Renin inhibitor ACEI ARB Angiotensinogen Vaccines Renin Vaccine Ang I Vaccine Ang II Vaccine ATR1 Vaccine 1987,Michel JB 2000,Michel JB 2007, Bachmann MF 2005,Liao YH Renin Angiotensin I ACE Angiotensin II ATR1 Vasoconstruction Volume retension Hypertension Liudong Li, Yu-Hua Liao*, et al. Circulation, 2005, 112(Abstract Supplement):Ⅱ176-177.

瑞士-CYT006-AngQb 血管紧张素Ⅱ 降压疫苗 Ⅱ期临床实验：有效、安全 VLP Ramipril AngQb 抗体滴度与血压下降 The change of MABP at week 14 was –9.0/–4.0 mmHg (p=0.015 for SBP, p=0.064 for DBP); A change at 0800 h of –25 mm Hg in SBP (p<0.0001) and −13 mmHg in DBP (p=0.0035). Alain C Tissot, et al. Lancet. 2008, 371:821-27. Patrice M. Ambühl et al. J Hypertens. 2007, 25:63–72. 19

2012年11月26日，Hypertension杂志在线发表 我国首个自主研发的高血压疫苗研究重大进展 AHA(美国心脏协会) 官方杂志 2011影响因子6.207 针对血管紧张素II 1型(AT1)受体的治疗性疫苗在高血压动物中的有效性和安全性 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416. 20

实验动物及给药方案 雄性BALB/c小鼠， 8周龄，随机分为4组，每组10只 雄性自发性高血压大鼠， 6周龄，随机分为4组，每组9只 ATRQβ-001疫苗组：分别在第0天和14天皮下注射100μg ATRQβ-001疫苗 VLP组：分别在第0天和14天皮下注射100μg QβVLP 缬沙坦组：口服缬沙坦10mg/kg/d 对照组：注射相同体积的磷酸盐缓冲液(PBS) 第14、20、27和36天进行ATR-001特异性抗体效价筛查 BALB/c小鼠： 近交系小鼠，毛色为白色 常用于免疫学研究 第21天，小鼠经2%异氟烷麻醉后，在无菌条件下皮下植入渗透压微泵，给予Ang II 1.4mg/kg/d，共给药14天 雄性自发性高血压大鼠， 6周龄，随机分为4组，每组9只 ATRQβ-001疫苗组：分别在第0、14和28天皮下注射300μg ATRQβ-001疫苗 VLP组：分别在第0、14和28天皮下注射300μg QβVLP 缬沙坦组：口服缬沙坦10mg/kg/d 对照组：注射相同体积的PBS 第0、7、14、28、42、56、70、98和120天进行ATR-001特异性抗体效价筛查 自发性高血压大鼠： 近交系大鼠，毛色为白色 常用于高血压病研究 WKY大鼠 分别在第0、14和28天皮下注射300μg ATRQβ-001疫苗 分别在第7、35、63和105天处死以进行组织学评价 第0、7、14、28、35、42、49、63、77和105天进行ATR-001特异性抗体效价筛查 WKY大鼠： 近交系大鼠，毛色为白色 常用于高血压研究正常对照 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416. 21

ATRQβ-001疫苗有效降低动物血压 ATRQβ-001疫苗使AngⅡ诱导高血压小鼠的收缩压显著降低多达35 mmHg (143 vs 178mmHg) ** AngⅡ 180 ** ** 80000 * 160 小鼠ELISA效价 60000 VLP+AngⅡ组 ATRQβ-001疫苗+AngⅡ组 对照组 缬沙坦+AngⅡ组 小鼠收缩压水平(mmHg) 140 40000 20000 120 14 21 28 35 100 21 28 35 时间(天) 时间(天) *P＜0.05, **P＜0.01 vs VLP+AngⅡ组 ATRQβ-001疫苗使自发性高血压大鼠的收缩压降低多达19 mmHg (173 vs 192 mmHg) 16000 12000 210 ** ** ** ** ** ** 8000 195 大鼠ELISA效价 大鼠收缩压水平(mmHg) 180 ATRQβ-001疫苗组 对照组 缬沙坦组 VLP组 4000 165 21 42 63 84 105 126 150 **P＜0.01 vs VLP组 时间(天) 28 56 84 112 140 时间(天) Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

ATRQβ-001疫苗有效预防 高血压诱导的大鼠心脏重塑 左心室质量/体重(mg/g) * 缬沙坦组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 舒张末期室间隔厚度(mm) * 缬沙坦组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 * 舒张末期左室后壁厚度(mm) * 缬沙坦组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 舒张末期左室内径(mm) * 缬沙坦组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 ** * *P＜0.05, **P＜0.01 vs VLP组 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

ATRQβ-001疫苗显著改善 自发性高血压大鼠的心肌肥大 疫苗组 VLP组 缬沙坦组 缬沙坦组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 心肌细胞直径(μm) * 50μm 50μm 50μm 20μm 20μm 20μm 自发性高血压大鼠的心肌细胞直径 *P＜0.05 vs VLP组 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

ATRQβ-001疫苗有效预防 自发性高血压大鼠肾损伤 肾小球基底膜保持完整 ATRQβ-001疫苗组的 肾小球系膜细胞无明显增殖 缬沙坦组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 自发性高血压大鼠的肾小球基底膜 缬沙坦组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 自发性高血压大鼠的肾小球系膜细胞增殖 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

ATRQβ-001疫苗未导致明显免疫介导损伤 心 肾 脾 肺 肝 对照组 ATRQβ-001疫苗接种后第105天，在WKY大鼠各器官中未见免疫介导损伤 50μm ATRQβ-001疫苗组未观察到肾小球基底膜免疫复合物，且肾小球结构完整 ATRQβ-001疫苗组 ATRQβ-001 疫苗组 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

抗ATR-001抗体 可特异性地与AT1受体结合 免疫印迹法 免疫荧光法 对照抗体 抗ATR-001抗体 中和抗体 SASMC 55kDa 40kDa 抗ATR-001抗体 对照抗体 SASMC* 对照抗体 抗ATR-001抗体 中和抗体 SASMC 稳定表达人AT1受体的HEK293细胞 55kDa 40kDa 抗ATR-001抗体 对照抗体 20μm 抗ATR-001抗体 中和抗体 SASMC 稳定表达 人AT1受体的 HEK293细胞 HEK 293 20μm * SASMC：small arterial smooth muscle cells,小动脉平滑肌细胞 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

GAPDH： 3-磷酸甘油醛脱氢酶，用作内标 ATRQβ-001疫苗显著降低 自发性高血压大鼠心肾AT1受体的表达 ATRQβ-001疫苗组 AT1受体信使RNA表达显著下调 ATRQβ-001疫苗组 AT1受体蛋白表达显著下调 心脏 肾脏 心脏 ATRQβ-001疫苗组 心脏 肾脏 † 缬沙坦组 * VLP组 * AT1受体 † AT1受体信使RNA表达水平 与VLP组相比， GAPDH * * † AT1受体/GAPDH † 肾脏 ATRQβ-001疫苗组 缬沙坦组 VLP组 ATRQβ-001 疫苗组 缬沙坦组 AT1受体 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 缬沙坦组 GAPDH 心脏：*P＜0.05 vs VLP组 肾脏： † P＜0.05 vs VLP组 GAPDH： 3-磷酸甘油醛脱氢酶，用作内标 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

自发性高血压大鼠循环或局部RAS明显反馈激活 ATRQβ-001疫苗未引起 自发性高血压大鼠循环或局部RAS明显反馈激活 ATRQβ-001疫苗组 血浆肾素活性无明显变化 ATRQβ-001疫苗组 血浆AngⅡ浓度无明显变化 ATRQβ-001疫苗组 心肾AngⅡ浓度无明显变化 心脏 * 肾脏 * 血浆肾素活性(pmol/h/L) 血浆AngⅡ浓度 (pmol/L) 局部AngⅡ浓度 (fmol/g) ATRQβ-001 疫苗组 ATRQβ-001 疫苗组 ATRQβ-001 疫苗组 VLP组 缬沙坦组 VLP组 缬沙坦组 缬沙坦组 VLP组 *P＜0.05 vs VLP组 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

有效抑制Ang Ⅱ介导的蛋白激酶C-α易位 蛋白激酶C-α在诱导细胞增殖和抑制细胞凋亡方面发挥重要作用 抗ATR-001抗体 有效抑制Ang Ⅱ介导的蛋白激酶C-α易位 对照抗体 + AngⅡ 对照抗体 抗ATR-001抗体 10μm 氯沙坦 + AngⅡ 抗ATR-001抗体 + AngⅡ 中和抗体 + AngⅡ 10μm 蛋白激酶C-α在诱导细胞增殖和抑制细胞凋亡方面发挥重要作用 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

Ang Ⅱ介导的细胞外信号调节激酶1/2磷酸化 抗ATR-001抗体有效抑制 Ang Ⅱ介导的细胞外信号调节激酶1/2磷酸化 抗ATR-001抗体 + AngⅡ 中和抗体+ AngⅡ 对照抗体 + AngⅡ 氯沙坦+ AngⅡ 抗ATR-001抗体 对照抗体 氯沙坦 P-ERK# #P-ERK：磷酸化细胞外信号调节激酶 ##T-ERK：总细胞外信号调节激酶 T-ERK## 细胞外信号调节激酶1/2是重要的信号转导分子，该激酶被上游蛋白磷酸化后成为活化形式，进一步作用于胞浆内多种信号分子或细胞骨架蛋白，并可直接进入核内通过作用于转录因子，调控基因表达 P-ERK/T-ERK * † * *P＜0.05 vs 对照抗体组 † P＞0.05 vs 氯沙坦组 对照抗体 对照抗体 + AngⅡ 氯沙坦 氯沙坦+ AngⅡ 抗ATR-001抗体 + AngⅡ 中和抗体+ AngⅡ 抗ATR-001抗体 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

抗ATR-001抗体不与Ang II竞争结合AT1受体 缬沙坦与AngⅡ竞争性结合AT1受体 且具有剂量依赖性 抗ATR-001抗体 未与AngⅡ竞争性结合AT1受体 IC50 # =18.4 nmol/L 置换比例(%) [125I]-Ang II 置换比例(%) [125I]-Ang II 氯沙坦对数(mol/L) 抗ATR-001抗体对数(mol/L) # IC50: 50% inhibitory concentration, 半数抑制浓度 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

第0、7、14、28、35、42、49、63、77和105天进行抗ATR-001抗体效价筛查 95%置信区间为(9.1-34.4) 12500 10000 7500 ELISA效价 ELISA效价 5000 2500 14 28 42 56 70 84 98 112 时间(天) 时间(天) Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416. 33

在WKY大鼠各器官巨噬细胞及其他免疫细胞中未见明显浸润 ATRQβ-001疫苗 未导致明显炎症细胞浸润 ATRQβ-001疫苗接种后第63天， 在WKY大鼠各器官巨噬细胞及其他免疫细胞中未见明显浸润 心 肾 脾 肺 肝 对照组 ATRQβ-001 疫苗组 CD14 巨噬细胞 CD19 B淋巴细胞 10μm Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

ATRQβ-001疫苗 有望为原发性高血压的治疗提供新的途径 研究结果表明： ATRQβ-001疫苗可通过抑制Ang Ⅱ启动的信号转导过程而有效降低AngⅡ诱导高血压小鼠及自发性高血压大鼠的血压水平 ATRQβ-001疫苗为原发性高血压的治疗提供了新的途径 与传统化学药物相比， ATRQβ-001疫苗具有以下潜在优势： 未引起循环或局部RAS明显反馈激活 抗体半衰期长达14.4天，明显长于目前已知的降压药物 预示ATRQβ-001疫苗可提供更平稳的降压疗效，更好的靶器官保护作用，及更优的依从性 Chen X, et al. Hypertension. 2013;61:408-416.

结束语 免疫与高血压证据：CRP、细胞因子、抗血管受体抗体 血管紧张素Ⅱ、盐和慢性应激等刺激中枢神经系统，交感神经冲动增加肾脏IL-6产生改变T细胞的极性 肾脏和血管产生的IL-6和TGFβ与辅助T 细胞产生IL-17相互作用，IL-17促进ROS生成，导致血管收缩、钠潴留，最后产生严重的高血压 DC细胞提呈给T细胞，活化T细胞与单核/巨噬细胞相互作用产生免疫应答—抗AT1受体抗体—ARB针对性治疗 高血压患者存在免疫系统被激活，治疗性降压疫苗成为新的研究领域

教育部生物靶向治疗重点实验室 华中科技大学附属协和医院心血管病研究所 谢谢 37