第四章-1 细胞融合 Cell Fusion.

Slides:



Advertisements
Similar presentations
第四节 RNA 的空间结构与功能. RNA 的种类和功能 核糖体 RNA ( rRNA ):核蛋白体组成成分 转移 RNA ( tRNA ):转运氨基酸 信使 RNA ( mRNA ):蛋白质合成模板 不均一核 RNA ( hnRNA ):成熟 mRNA 的前体 小核 RNA ( snRNA ):
Advertisements

植物生理 植物细胞生理基础 同工酶. 学习目标 Click to add title in here Click to add title n here  掌握同工酶的概念。  了解同工酶的意义。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
第九章 核酸的降解 与核苷酸代谢.
第 二章 动物细胞融合
分子生物学部分开发实验 植物遗传亲缘关系研究.
Metabolism of Nucleotides
龙星课程—肿瘤生物信息学上机课程 曹莎
百年诺贝尔 之 2003年诺贝尔奖.
第十四章 细胞融合技术 化学与生命科学学院.
葡萄糖 合成 肌糖元 第六节 人和动物体内三大营养物质的代谢 一、糖类代谢 1、来源:主要是淀粉,另有少量蔗糖、乳糖等。
第三节 动物细胞工程 细胞融合和单克隆抗体 南京中华中学 生物组 张萍.
第九章 植物原生质体融合技术.
主题3 生命的结构基础 细胞是生物体结构和生命活动的基本单位,生物体的代谢活动几乎都在细胞内有条不紊的进行着。
人类伟大工程 ——单克隆抗体技术.
碘量法应用与实例:维生素C含量测定.
第七节 维生素与辅因子.
生命的物质基础.
细胞核是遗传信息库.
C 1.关于生物体内的遗传物质 下列说法正确的是( ) A.细菌的遗传物质主要是DNA B.病毒的遗传物质主要是RNA
问 题 探 讨 1.DNA的中文全名是什么? 2.为什么DNA能够进行亲子鉴定? 3.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗?
基因的表达 凌通课件.
第33章 核酸的降解和核苷酸代谢.
第十章 核苷酸代谢 Chapter 9 Metabolism of nucleotide
第七章 动物细胞培养 动物细胞融合 动物细胞融合:(cell fusion)
通过长期的实验,科学家们采用体细胞杂交技术获得了种属间杂种植株 如:“番茄—马铃薯”植株。
第十一章 核酸的酶促降解和核苷酸代谢 本章重点讨论核酸酶的类别和特点,对核苷酸的生物合成和分解代谢作一般介绍。 第一节 核酸的酶促降解
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
第一篇 细胞生理学 第一章 生物膜的物质转运功能 第二章 细胞的兴奋 第三章 细胞间信息传递 第四章 肌细胞的收缩功能.
骨质疏松症的遗传学研究(part 2) Hong-Wen Deng, Ph.D. Osteoporosis Research Center
細胞膜的雙磷脂層 (Phospholipid bilayer in cell membrane)
杂交瘤技术制备单克隆抗体的实验原理.
第六章 核酸类物质的积累机制 核酸发酵是在氨基酸发酵基础上的进一步深化和发展的代谢控制发酵,即以代谢控制理论为依据,设法造就(选育)从遗传角度解除了正常代谢控制机制的突变株。
细 胞 融 合 ——牛蛙红细胞的体外融合.
Water potential in the plant
Chapter 3 Protoplast Culture & Somatic Hybridization
第12章 核酸与核苷酸代谢 主讲教师:卢涛.
第3节 遗传信息的携带者 —— 核酸.
膜糖的存在方式 ◆More than 90 percent of the membrane's carbohydrate is covalently linked to proteins to form glycoproteins; the remaining carbohydrate is covalently.
ATP SLYTYZJAM.
电导分析法的应用 applications of conductometry
第二节 免疫球蛋白的类型 双重特性: 抗体活性 免疫原性(抗原物质).
第四节 基因定位常用的方法 Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于X染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968年,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因定位于1 号染色体上,是人类首次在常染色体上进行的基因定位.20世纪70年代后,体细胞杂交重组DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用,基因定位的方法愈加先进,基因定位的速度、数量明显加快。人类基因组计划的实施和完成,更加促进了基因定位的进程。
第二章 细胞的基本功能 第一节 细胞膜的结构和物质转运功能 第二节 细胞的信号转导 第三节 细胞的电活动 第四节 肌细胞的收缩.
第六章 细胞融合 (Cell fusion).
实验十 细胞融合与血红细胞渗透性的观察 实验1: 细胞融合实验及观察 实验2: 红细胞膜渗透性观察.
胚胎干细胞生物学特性和研究进展.
第二节 DNA分子的结构.
第六章 细胞融合.
第3节 细胞核——系统的控制中心 本节聚集: 1.细胞核有什么功能? 2. 细胞核的形态结构是怎样的?
细胞的结构和功能 细胞是生物体结构和生命活动的基本单位,其结构包括细胞膜、细胞质、细胞核,细胞必须保持完整性,才能完成正常的各项生命活动.
超越自然还是带来毁灭 “人造生命”令全世界不安
第14章 细胞融合与单克隆抗体 14.1 细胞融合 14.2 杂种细胞的应用 14.3 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术.
遗传物质--核酸 核酸分子组成 核酸分子结构.
有关“ATP结构” 的会考复习.
光合作用的过程 主讲:尹冬静.
基于高中生物学理性思维培养的实践性课例开发
H基因库(重链基因连锁群): --- 第14号染色体 κ基因库(κ链基因连锁群): --- 第2号染色体 λ基因库(λ链基因连锁群):
生物 选修3 现代生物科技专题.
CHAPTER 11 Cell Nucleus and Chromosome.
遗传病的分析3 培养细胞的染色体制备.
基因信息的传递.
BAFF在活动性SLE患者T细胞中的表达:
细胞分裂 有丝分裂.
第三节 数量积 向量积 混合积 一、向量的数量积 二、向量的向量积 三、向量的混合积 四、小结 思考题.
五.有丝分裂分离和重组 (一) 有丝分裂重组(mitotic recombination) 1936 Curt Stern 发现
病理生理学教研室 细胞信号通路检测(一) 总蛋白提取.
9.6.2 互补对称放大电路 1. 无输出变压器(OTL)的互补对称放大电路 +UCC
讨论:利用已经灭绝的生物DNA分子,真的能够使灭绝的生物复活吗?
第二章 组成细胞的分子 第3节 遗传信息的携带者——核酸 (第二课时).
Presentation transcript:

第四章-1 细胞融合 Cell Fusion

细胞融合 细胞融合概念 融合方法 融合过程 融合的影响因素

一、 细胞融合的概念 细胞融合(cell fusion):又称somatic hybridization or cell hybridization ,指在自然条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性方式融合形成一个杂合细胞的过程。 它能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息,是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体定位、改良动物遗传特性及创造新的符合人类需要的新的细胞系极为有效的手段。 自发融合:受精过程,成肌细胞融合,巨噬细胞融合,体外培养系统中的细胞融合 诱发融合

1962年Okata发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体,开创 动物细胞融合的暂新领域。

Singer and Nicolson’s Model of membrane structure: The fluid-mosaic model is the “central dogma” of membrane biology. The core lipid bilayer exists in a fluid state, capable of dynamic movement. Membrane proteins form a mosaic of particles penetrating the lipid to varying degrees. The Fluid Mosaic Model, proposed in 1972 by Singer and Nicolson, had two key features, both implied in its name.

The chemical composition of membranes A. Membrane Lipids: The Fluid Part of the Model Membrane lipids are amphipathic. There are three major classes of lipids: Phospholipids: Phosphoglyceride磷酸甘油酯and sphingolipids Glycolipids Sterols ( is only found in animals)

An Overview of membrane functions 1. Define the boundaries of the cell and its organelles. 2. Serve as loci for specific functions. 3. provide for and regulate transport processes. 4. contain the receptors needed to detect external signals. 5. provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion

细胞融合的关键:脂双层的接触靠近, 细胞桥形成, 胞质渗透-细胞核融合。 Hydrophobic 疏水的 Hydrophilic 亲水的 蛋白分子 极性孔 细胞融合机理 细胞融合的关键:脂双层的接触靠近, 细胞桥形成, 胞质渗透-细胞核融合。 寡糖 鳌合蛋白 糖脂 疏水a螺旋 磷脂 胆固醇

二、诱发细胞融合的方法 病毒 化学-PEG 电融合

1.病毒促进细胞融合 病毒类融合剂是研究的最早的促融剂,一些致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等,都能诱导细胞融合,但由于毒性大,应用上收到很大限制。 仙台病毒(HVJ)是一类被膜病毒,诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA,而是它的外膜。 这一现象对你有何启示?

HVJ促融机制: 当病毒位于两个细胞间时,病毒表面spike上神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白,使细胞膜局部聚集在病毒周围,在高pH和Ca2+条件下局部细胞膜发生融合。

2.化学融合剂促进细胞融合 1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethylene glycol,PEG)可促进细胞融合, Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。 PEG是一种多聚化合物,商品名卡波蜡Carbowax,分子量200-20000,靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷,目前已衍生达50多种。

聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合 原理:PEG带有大量的负电荷,和细胞膜表面的负电荷在Ca2+的连接下,形成静电键,促使异源的细胞膜间的粘着和结合,在高pH,高Ca2+溶液的作用下,将Ca2+和与质膜结合的PEG分子洗脱,导致电荷平衡失调并重新分配,使两种细胞膜上的正负电荷连接起来,进而形成具有共同质膜的融合体。

注意事项 1 PEG融合的关键是作用时间 2 PEG规格和纯度与融合效率有关 3 融合与细胞密度有关 3 融合与细胞密度有关 4 融合液中加入少量CaCl2,即维持一定电导率,对细胞也有保护作用

3.电融合技术(Electroporation) 20世纪80年代兴起,以电降解及双向电泳的联合作用为基础,在高频交流电脉冲的诱导下,两个细胞膜表面的电荷和电位发生改变,导致该区域膜结构紊乱,出现许多微膜孔,相邻两个细胞紧密排列的微孔会有物质交流,形成膜桥和质桥,近而产生融合。当外加电场被撤除后,孔道由细胞自行修复,细胞膜通透性和功能恢复正常。

20世纪80年代兴起,以电降解及双向电泳的联合作用为基础,在高频交流电脉冲的诱导下,两个细胞膜表面的电荷和电位发生改变,导致该区域膜结构紊乱,出现许多微膜孔,相邻两个细胞紧密排列的微孔会有物质交流,形成膜桥和质桥,近而产生融合。当外加电场被撤除后,孔道由细胞自行修复,细胞膜通透性和功能恢复正常。

融合的基本过程: A、细胞膜的接触:当细胞置于电导率很低的溶液中时,电场通电后,电流即通过细胞,在电场作用下极化而产生偶极子,从而使细胞紧密接触排列成串; B、膜的击穿:细胞成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使细胞膜击穿,从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 C、关于融合参数:电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间;直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。

3

注意事项 1)对介质要求高,一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液,如甘露醇等配制等渗性介质。 2)注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间,以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。

融合参数:主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间;直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。

优点: 融合率高,达70%-80%,甚至100% 融合率=(融合组多核细胞的核数-对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数)×100% 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞

第二节 融合细胞的筛选 原理:两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞,筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 1)亲本 第二节 融合细胞的筛选     原理:两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞,筛选的目的是获得优良的杂种细胞。     1)亲本     2)同核体homokaryon :同源细胞融合体,它们的基因型和表现型完全一样。     3)异核体heterokaryon :异源细胞的融合体,它们含有双亲细胞核和细胞质物质。     4)多核体:含有双亲不同比例核物质的融合体     5)异胞质体:具有不同胞质来源的杂合细胞。     6)核质体:有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体 融合细胞的类型: 1 同核体homokaryon :同源细胞融合体,它们的基因型和表现型完全一样。 2 异核体heterokaryon:异源细胞的融合体,它们含有双亲细胞核和细胞质物质。 A 含有两方的核基因、细胞质和细胞器群体 B 含有两方的核基因和其中一方的细胞质和细胞器群体 C 含有其中一方的核基因和两方的细胞质和细胞器群体 D 含有其中一方的核基因和另一方的细胞质和细胞器群体 3 多核体: 含有双亲不同比例核物质的融合体。

动物细胞融合的筛选方式: 1)利用抗药性筛选系统:利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A:对氨苄青霉素敏感,对卡那霉素不敏感 亲本B:对卡那霉素敏感,对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长

2)营养互补筛选系统:细胞在缺乏一种或几种营养成分时,不能生长繁殖,即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A:色氨酸缺陷型 亲本B:苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养,而亲本细胞均会死亡。

3)温度敏感突变型杂种细胞的筛选:一般的培养细胞能在37度范围内生长,但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一:具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 亲本二:高温敏感突变型,但不能抗卡那霉素。 杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长。

4 具有所需性状杂种细胞的筛选

HAT选择系统--基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 HAT是含一定浓度次黄嘌呤(Hypoxanthine,H)、氨基喋呤( Aminopterin,A )及胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)的一种选择性培养基,其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种: 主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸,进而合成DNA,叶酸是必不可少的媒介,参与嘌呤和嘧啶甲基合成,氨基蝶呤抑制FH2活性,阻断FH2到FH4合成。 主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸,进而合成DNA,叶酸是必不可少的媒介,参与嘌呤和嘧啶甲基合成, 氨基蝶呤抑制FH2活性,阻断FH2到FH4合成。 需两种酶:胸腺嘧啶核苷激酶TK酶——TK酶(催化次黄嘌呤产生肌苷); 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶——HGPRT酶(催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸)。 细胞内核苷酸生物合成途径有二: 1.从头合成 2.应急途径 需两种酶:胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: (催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸) 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶: (催化次黄嘌呤产生肌苷)

杂交瘤技术中,常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(HPRT-)骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)骨髓瘤细胞为亲本之一。 含氨基喋呤A培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。

基于HAT培养基的筛选系统 H(Hypoxanthine次黄嘌呤)应急途径中所提供之外源核苷酸前体 A(Aminopterin,氨基喋呤)阻断核苷酸的从头合成 T(Thymidine,胸腺嘧啶)应急途径中所提供之外源核苷酸前体 HGPRT酶缺陷型细胞株(长期培养系) 不能在HAT培养液中生长 最后,只有融合细胞在HAT培养液中存活 融合细胞 体外生存能力有限,最终也将死亡 正常细胞

第三节 融合细胞克隆化 方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。 在培养过程中,一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞,如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。 方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。

有限稀释法 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的 1)取出阳性孔内的细胞进行计数 2)用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。 3)如果在96孔板内每孔加0.1ml,每孔内将为一个细胞 4)加入一定数量的饲养细胞,经过8~12天后, 可观察到有集落生长的孔。 5)根据检测的阳性结果再次进行克隆化。

软琼脂培养法 在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5%的琼脂,待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25%的软琼脂。待细胞长成集落后,用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。

第四节 杂种细胞在细胞生物学研究中的应用 1)基因定位 不同种属的细胞融合时,常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除,而另一个亲本的染色体被选择性留下,即染色体分离的现象。由此,可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上。 例如 :HGPRT-人细胞与TK-的小鼠细胞融合后,可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色体的杂种细胞,具有TK活性,由此得到人的TK基因是在E组染色体上的。

2)体细胞杂种的致瘤性分析 通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。 3)遗传缺陷的基因互补 基于杂种细胞的基因互补作用,可分为基因间和基因内的互补作用,即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补,可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。

4)分化功能表达调控的研究 通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种,同时对杂种细胞内的基因组和胞质观察和分析,了解如何通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状熄灭或保留。

思考题 1 什么是细胞融合?有怎样的意义? 2 细胞融合的主要方法有哪些?各有什么特点? 3 HAT的选择原理是什麽?

本章结束 谢谢!