第九章 微生物与基因工程

基因工程的研究内容 基因工程概述 基因工程的载体和工具酶 基因工程的成就和研究进展 转基因植物 转基因动物 基因治疗

第一节 基因工程概述 基因工程的诞生和发展 基因工程的概念 基因工程研究的基本步骤 微生物与基因工程的关系

（斯坦福大学的S. Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性重组质粒分子导入大肠杆菌的转化子菌落) 一、基因工程的诞生和发展 一般认为1973年是基因工程诞生的元年 （斯坦福大学的S. Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性重组质粒分子导入大肠杆菌的转化子菌落) 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。

1、DNA是遗传物质被证实 2、DNA双螺旋模型的提出 3、“中心法则”和“操纵子学说”的提出 4、工具酶的发现和应用 限制性内切酶 DNA连接酶 反转录酶 5、载体的发现及其应用 DNA的体外重组 6、重组子导入受体细胞技术

基因工程诞生 1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。在美国PNAS上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro”的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术 1973年被定为基因工程诞生的元年。

涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴六个字表示 二、基因工程的概念 基因工程（genetic engineering）或 重组DNA技术(ercombinant DNA technology) 在分子水平上，提取或合成不同生物的遗传物质，在体外进行切割、再和某一载体进行拼接重组，然后再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。 涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴六个字表示

三、基因工程研究的基本步骤 1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段） 2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到 繁殖，从而使得目的基因得到扩增。 5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如， 序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究 和利用等。

1.DNA片段的获得 （1）从基因文库（gene library）或cDNA文库中分离，或从供体生物体直接取得 限制性内切酶（restriction enzymes） mRNA反转录成cDNA 逆转录酶—Reverse ranscriptase （2）人工合成DNA片段（DNA合成仪） （3）PCR反应合成DNA （4）基因的定位诱变 （5）用机械的方法 超声波

四、微生物学与基因工程的关系 一切基因工程操作都离不开微生物。 ①载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成； 一切基因工程操作都离不开微生物。　　 ①载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成； ②工具酶千余种,绝大多数来源于微生物； ③基因克隆的宿主，植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，再转移到植物和动物细胞中； ④基因表达的生物反应器将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，进行大规模发酵得到基因产物； ⑤基因资源微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，极其丰富而独特； ⑥理论研究有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。

第二节 基因工程的载体和工具酶 载 体 基因操作的工具酶

在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因进入宿主细胞的运载体 一、载体(carrier） 在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因进入宿主细胞的运载体 理想的基因工程载体应该具备以下特征： （1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在外源DNA插入之后，仍能保持稳定的复制状态和 遗传特性。 （2）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。 （3）在DNA序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点，这些位点位于DNA复制的非必须区内，可以在这些位点上插入外源DNA但不影响载体自身DNA复制。 （4）具有能够直接观察的表型特征，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标记。

常见的基因载体有 (一) 细菌质粒载体（plasimid vectors） （二）噬菌体载体（phage vectors） 噬菌体载体 M13噬菌体载体 柯斯质粒载体 （三）病毒载体 （四）酵母质粒载体

构建质粒载体，通常对质粒有以下几点要求： ⑴自身相对分子质量尽可能小； ⑵有用来克隆外源DNA的单一的限制性内切酶识别位点； ⑶有一个或多个选择标记基因，便于重组子的筛选； ⑷拷贝数较高； ⑸在宿主细胞内稳定性高； ⑹具有复制起始点。

1、质粒pBR322 结构： （1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr） 3种限制酶单一识别位点 。 pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 结构： （1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr） 3种限制酶单一识别位点 。 （2）四环素抗性基因（Tetr或Tcr） 内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点 。 （3）DNA复制起点（ori） pBR322 4361

二、 基因操作的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 碱性磷酸酶 逆转录酶 基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶 二、 基因操作的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 碱性磷酸酶 逆转录酶 基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶 Enzyme of tools 到目前为止常用的工具酶有300多种。

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 基因工程的手术刀 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。 最早分离出的限制内切酶—1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。 首个II型限制内切酶—1970年，H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。 从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。

3.II型限制性核酸内切酶的基本特点 1.切点专一，识别位点的特异性 每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8bp组成的特定序列（靶序列）。 2.识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。 3.切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。

几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点 CTGCAG Pst I Provindencia stuartii 164 GACGTC Haemophilus influenzae Rd

与II型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端 cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平 末 端 Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。

2.DNA连接酶作用的特点 A. 连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和 5’－P，而且这两个基团彼此相邻； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。 E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。 T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端， 需ATP辅助因子，活性高，常用。

是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P × × 是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick. gap NO Nick OK

第三节 基因工程研究的成就和研究进展 基因工程药物 在农业领域 在工业领域 基因治疗

一、基因工程药物 P291表10—3 1977年，激素抑制素的发酵生产成功。Itakara等，化学合成的激素抑制素基因和大肠杆菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重组质粒，并通过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有生物活性的激素抑制素。首首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，这相当于50万头羊脑的提取量。

1978年， Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。 1980年， Nagata等，遗传工程菌生产干扰素获得成功。 1981年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。 1982年， 重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。 1983年， 基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。

人胰岛素的生产方法： (1)从人的胰脏中直接提取； (2)由单个氨基酸直接化学合成； (3)由猪胰岛素化学转型为人的胰岛素； (4)利用基因工程菌大规模发酵生产重组人胰岛素

180美元

二、在农业上的应用 1.增加农作物产品的营养价值，如：增加种子、块茎的蛋白质含量，改变植物蛋白的必需氨基酸比例等。 2.提高农作物抗逆性能如：抗病虫害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能。 3.提高光合作用效率将是提高农作物产量的一个有效方法。 4.生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或具固氮能力，将代替无数个氮肥厂。 5.增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的 25% ，如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂的吗啡等。 6.运用转基因动物的技术，可培育畜牧业新品种。 7.其它。

植物转基因育种的发展优势 1、扩大了作物育种的基因库 2、提高了作物育种的效率 3、减轻了农业生产对环境的污染 4、拓宽了作物生产的范畴 转基因育种打破了常规育种的物种界限，来源于动植物和微生物的有用基因都可以导入作物，培育成具有某些特殊性状的新型作物品种。 2、提高了作物育种的效率 作物转基因育种不仅大大缩短育种年限，而且可成功地改良某些单一性状却不影响改良品种的原有优良特性。 3、减轻了农业生产对环境的污染 转基因抗虫抗除草剂的谷物、棉花、大豆的大面积种植和推广，不仅可以减少化学杀虫剂对棉农及天敌的伤害，而且可以大幅度降低用于购买农药和虫害防治的费用。另外，随着高效固氮转基因作物及高效吸收土壤中磷元素等营养元素的转基因作物不断问世农用化肥的利用率将极大地提高，这对减少农田污染具有重要意义。 4、拓宽了作物生产的范畴 各种有价值的蛋白产品都可以利用植物反应器进行高效生产，番茄、马铃薯、莴苣和香蕉等作物已被成功用于生产药物如人干扰素、抗体、口服疫苗。另外，各种工业原料转基因作物将可能生产出人类所需要的一切产品。

全球不同转基因作物和应用面积

植物基因工程研究 植物基因组计划 水稻、玉米、棉花、大豆、高粱和番茄 植物分子育种 高产、优质、高效和多抗性 植物作为反应器 香蕉、马铃薯、番茄等 酒精、石油、工业酶等

转基因动物 是指用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达，且能稳定地遗传给后代的动物。 1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。 按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。 1997年，英国科学家Schnieke和Wilmut等通过体细胞核移植技术成功克隆了“多莉”。 1997年6月Wilmut报道用胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊“波莉”。 1999年，美国科学家Alexander克隆了３头山羊，改变了它们的基因性状，使它们的乳液内含有一种对心脏病具有疗效作用的蛋白质。

三、工业领域 环保工业 能降解工业废品、农药残留等基因工程菌的构建 酶制剂工业 耐热、耐压、耐盐、耐溶剂的酶基因转化构建的工程菌 食品工业 改善食品品质的转基因作物 化学与能源工业 生产乙醇、甘油、丙酮等的转基因生物

四、基因治疗 基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，达到治疗目的的方法。 治疗的策略： 1.基因置换：就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。 2.基因修复：是指将致病基因的突变碱基序列纠正，正常部分予以保留。 3.基因修饰：是将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。 4.基因失活：利用反义RNA等技术及RNAi等能特异的封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。 5.免疫调节：是将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，从而达到治疗疾病的目的。

五、基因治疗的现状与展望 目前在美国及其它国家，大量的临床试验正批准用来检验基因治疗。研究人员试验用基因疗法来治疗基因紊乱，如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症、膀胱纤维症和家族性血胆脂醇过多症（血清胆固醇高）；血友病等遗传病；恶性黑素瘤、神经细胞瘤、白血病、肾癌、卵巢癌和脑癌等癌症；以及肝功能衰竭和艾滋病等。

我国基因工程部分研究进展 转基因抗病虫植物 转基因抗病虫植物　 我国科学家将抗虫基因导入棉花，获得了抗虫植株，对棉蛉虫的抗虫效果十分显著。抗黄矮病、赤霉病、白粉病转基因小麦和抗青枯病马铃薯也已研究成功，开始田间加代繁殖。

基因工程疫苗 乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者1亿 1千万人，其中40％左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在20多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入临床试验。

基因工程药物 干扰素是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了3个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，我 国还研制成功了肝癌导向药物（生物炸弹）、系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程药物，有些已获试生产文号或进入中试开发阶段。

动物克隆和转基因研究 在“神舟”五号成功着陆的同一天，包括两头转基因体细胞克隆牛在内的10头体细胞克隆牛现身山东梁山县。我国转基因体细胞克隆技术及体细胞克隆技术的研究与应用达到国际前沿水平。 体细胞克隆牛“乐娃”，由于成功地转入了绿色荧光蛋白基因，成为我国首例转基因体细胞克隆牛，标志着我国在转基因体细胞克隆技术方面的新突破。

同学们：该抓紧时间了！