第一章 分子克隆的工具酶 工具酶：进行DNA操作经常要用到的“工具”——酶.

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1 第一章 分子克隆的工具酶 工具酶：进行DNA操作经常要用到的“工具”——酶

2 修饰酶 modification enzyme
工具酶 （四大类） 核酸酶 nucleases 连接酶 ligase 聚合酶polymerase 修饰酶 modification enzyme 脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease 核糖核酸酶ribonuclease 外切酶 exonuclease 内切酶 endomuclease 限制性内切酶 非限制性内切酶 单链外切酶 双链外切酶

3 有人也简单的将它分为两类：限制酶和其他酶类：连接酶，聚合酶，核酸酶，激酶，磷酸酶。
上述酶的分类不是绝对的，因有的酶兼有数种功能，如：聚合酶有外切酶功能；内切酶有甲基化酶功能等。 四大酶类大都是从细菌和phage中纯化出来的，它们原本参与细菌/phage自身DNA的复制、转录、降解外源入侵DNA分子、修复突变、重组等一系列生命活动，被纯化后用来在人工条件下进行体内类似的反应。

4 第一节 限制性内切酶 （restriction enzyme ）
限制性内切酶：指能识别特定的DNA序列，在一定的条件下，可在识别位置上或附近对DNA进行切割的酶。 一、限制性内切核酸酶的发现 1952年Luria、Human在T偶数噬菌体、1953年weigle、Bertani在 λ 噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现。

5 噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力，取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。 例如，将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴 定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用(host—Controlled restriction)。

6 用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNA的降解。如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来，之所以能够如此，乃是通过稍 为宿主控制的修饰作用(host-controlled modification)。

7 限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNA的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制。修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。 到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restriction—modification system． R-M system)。该系统中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。

8 1968年，Meselson从E．coli K株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从 E．coli B株中分离到限制酶EcoB。遗憾的是，由于EcoK和EcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割 DNA，这个酶后来命名为HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的DNA片段就具有特别的意义。

9 二.限制性内切酶的命名 与种类 按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Smith 和Nathans对内切酶的命名提出建议，1980年，Roberts对限制性酶的命名进行分类和系统化。 限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 + 种名 + 株名的个一个首字母，再加上序号， A、 第一个字母大写，表示该酶来源的细菌属名的第一个字母 B、 第二、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前2个字母 C、第四个字母 大写 代表不同的变种/品系 小写 代表不同的菌株和型 D、最后罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶

10 H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 属名 种名 株名
属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 H i n d III H i n d III 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶

11 注意限制性内切酶的正确写法： 1、前3个字母一定斜体 2、字母与罗马数字间空格 如：EcoR I Pst I

12 三种类型限制性内切酶的特性比较 特性 I型 II型 III型 限制酶活性 ＋ 甲基化酶活性 － DNA的识别 切割特异性
随机，切割位点距识别序列 1kb以上 专一（特异位点上/附近） 距寄主特异性位点3，端24~26bp处 对ATP的依赖 Mg2+ S-腺苷 产物 异质，不均一 专一片段，大小一致

13 I类限制性内切核酸酶 I类限制性内切核酸酶的分子量较大, 一般在30万道尔顿以上, 通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由R(135kD)，M(62kD)和S(55kD)三种亚基组成的复合酶，这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为449kD,共5个亚基，其中R亚基和M亚基各两分子。 Ⅰ类酶不仅是一种核酸内切酶, 同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPase的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要Mg2+作辅助因子外, 还要求ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。Ⅰ类酶具有特异的识别序列，大约15个碱基对。 Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别DNA分子, 并能同DNA分子作用, 因其识别DNA后, 要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA(图), 所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。

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15 III 类限制性内切核酸酶 III类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于Ⅰ类酶, 作用方式基本同Ⅱ类酶。如EcoP1是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基)负责位点识别和修饰。另一个亚基(R亚基)具有核酸酶的活性(图3-5)。切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。

16 Ⅱ类限制性内切核酸酶 这类酶的分子量较小. 一般在2-4万道尔顿, 通常由2-4个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求, 而且对更远的碱基也有要求, 因此, Ⅱ类酶既具有切割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割。切割的方式有平切和交错切, 产生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的DNA片段(5'或3'粘性末端)。作用时需要Mg2+作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系, 第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。

17 三.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 与I型及III型核酸内切限制酶不同，II型核酸内切酶只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。
1、基本特性 它具有三个基本特性： a.  在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b.  2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.   因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。

18 a.识别位点： 绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而II型限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。 有些识别序列是连续的(如GATC)， 有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N是代表任意一种核苷酸碱基 切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构。 这段序列有两个基本的特征，第一是能够中在间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的5’到3’的序列组成相同，即将一条链旋转1800，则两条链重叠。

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20 检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一：
b. 切割类型 检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一： （1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

21 c.产生的末端特征： Ⅱ类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(cohesive end)。 粘性末端是指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。 已知有两种不同类型的限制酶都可以产生粘性末端，但一种是形成具有3’粘性末端，例如Pst I酶就是属于这种类型；另一种则是形成具有5’粘性末端，例如EcoR I酶便是此种类型的一个代表。 粘性末端能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来， 平末端的DNA片段则不易于重新环化。

22 5 ’ G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
EcoR I等产生的5’粘性末端 5 ’ G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3’ C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoR I 37 ℃ 5’ G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3’ 3’ C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’ 退火 4-7 ℃ OH P 5’ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’ P OH

23 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’
Pst I等产生的3‘粘性末端 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ Pst I 37 ℃ 5 ’ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3 ’ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 退火 4-7 ℃ OH P 5 ’ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3 ’ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ P OH

24 Pvu II等产生的平头末端 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3 ’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ Pvu II 37 ℃ 5 ’ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3 ’ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’

25 2、限制性内切核酸酶的切割频率 切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率，理论上应为1/4n，n表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点(1/44=1/256)，识别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。 实际上因DNA的分布是不均一的,且有大量的重复序列,加上内切酶的切点具有GC倾向,所以实际的频率偏低。如同是识别6个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大∶EcoRI 4000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:200

26 3、同裂酶 (isoschizomers) 来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。 同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶HpaⅡ和Msp I是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。 但是也有产生不同的切割

27 4、 同尾酶  (isocaudamer) 与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 常用的BamH I,Bcl I,Bgl II,Xho I就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。

28 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybrid site)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：Sal I（5`-G   TCGAC-3`）和Xho I(5`-C  TCGAG-3`)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。 但也有例外，可以被识别序列为4碱基的酶切。

29 5、酶活性单位： 1单位限制性内切酶（1 U）通常定义：在建议使用的Buffer及温度下，在20 l（50 l ）反应体系中反应1小时，使1 g入DNA完全消化所需的酶量. 6、星活性（star ctivity） ： 在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。所谓非最适的反应条件：过量酶、低盐浓度、过量甘油、高pH（8.0以上）、有机溶剂ex：酒精（EcoR I对酒精敏感）、SDS、苯酚、氯仿等。

30 四.使用内切酶时应注意的事项 1、根据实验目的、片段长度（识别序列长，产生片段长，基因的完整性好）、方便连接（粘性末端连接效益高、不同酶产生的粘性末端连接效率不同）来选择正确的酶。 2、酶的保存： 一般保存 50%甘油，-20℃有霜冰箱 长期保存 50%甘油，-70℃有霜冰箱

31 3、酶的使用： A、反应体积尽量保持最小（一般20-50l），酶液的体积不超过反应总体积的10%，使甘油浓度小于5%，防止产生星活性； B、反应体系的成分中，酶最后加； C、取出使用应放在冰上，用完后立即放回冰箱，尽量避免反复冻融； D、多样品酶切时，先计算总量，取出酶稀释后再分别加至各管； F、每次取酶必须使用新的无菌吸头。

32 G、多种酶同时酶解时：可共用一种buffer时，则两种酶的酶切反应可同时进行；但如需不同的buffer时，则先低盐后高盐，如果对酶切效率影响不大，也可使用通用buffer；如果难以同时进行，一般采用一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。 H、酶切反应的终止：一般65℃，15’后电泳，但是有些酶65℃不失活。如EcoRV，则要用酚氯仿抽提。 I、酶解后电泳分析体积过量时，可以用2.5倍体积冷乙醇，在液氮中放置15’，如低盐buffer，则还须补加3 mol/L NaAc至1/10体积；也可用0.6体积的5 mol/L 乙酸胺和2倍体积的乙醇，在冰上放置5分钟，然后于4℃、12000g，离心5分钟；或 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4，2.5倍体积的冰冷乙醇，冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、风干。

33 五.影响限制性核酸内切酶活性的因素 1、DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等将影响DNA样品的纯度。
加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶(但是不能超总体积1/10 加大反应总体积 延长反应时间

34 在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。

35 2、DNA样品的甲基化程度： 核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。 为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 可以利用不同的限制性内切酶对甲基化敏感程度不同，研究不同条件下DNA的甲基化程度。

36 3、缓冲液性质： 标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。

37 缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7．4的条件下，其功能最佳。
巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。 有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度。

38 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。
如EcoR I在正常条件下识别并切割5’GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5’PuPuATPyPy3’或者5’AATT3’。

39 4、酶切反应的温度 DNA酶切反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。 但也有许多例外的情况，它们要求37℃以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃，例如Sma I是25℃、Apa I是30℃。

40 有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37℃，例如Mae I是45℃、Bcl I是50℃、Mae lII是55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60℃以上。
消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。

41 六. 酶切的方式： 1、完全酶切：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 2、不完全酶切：只有有限数量的酶切位点被切开，可以通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。

42 第二节 连接酶（ligase) 一、连接酶的功能： 1、间断修复功能 概念 ：
间断（discontinuity）：指DNA的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二脂键发生断裂。 缺口（nick）：指某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。 2、连接功能 ：将两个双链DNA连接在一起

43 二、连接酶的作用机理与反应条件： 1、作用机理： （1）ATP（NAD+)提供激活的AMP （2）ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 （3）AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。

44 （4）AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。

45 （5） 3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。

46 2、反应条件 （1）必须是两条双链DNA，如果为粘性末端，末端必须配对。 （2）DNA的3’端有游离的-OH’，5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量： 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+

47 三、连接酶的种类和特点 ： 1、T4-DNA连接酶 能够催化平末端和粘性末端的双链DNA分子间相互连接，加入低浓度PEG（体积排阻剂）可提高溶液中大分子间的相互作用，促进连接。还可作用于RNA，但效率很低。 dNTP存在不抑制T4DNA连接酶活性，该酶在所有DNA限制酶buffer中均能很好起作用。 需要ATP。

48 2、E.coli DNA连接酶 ： 作用于带上5’或3’突出末端的双链DNA分子的连接（粘性末端连接）不能作用于平端（但现发现在PEG或Ficoll等体积排阻剂存在下，由于排阻剂提高了DNA末端和酶的浓度，在排阻剂存在下也可以连接平端DNA，但效率较低），不能连接RNA。 需要 NAD+ 3、T4-RNA连接酶：催化5’P的单链RNA或DNA与含3’-OH的单链RNA或DNA之间的连接。

49 四、连接酶的活性 单位： 一般采用 Weiss 单位来衡量 T4 DNA 连接酶的活性。在 37℃ 下 20 分钟催化 1 nmol 32p 从焦磷酸根置换到[， 32P]ATP 所需的酶量，定义为 1 个 Weiss 单位。该定义方法基于 ATP 和焦磷酸的交换，是最常用的连接酶单位， 但该定义所展示的直观生物学意义不显著。 New England Biolabs 公司也提出了一种定义方式，通过粘性末端的连接效率来表示。即，在 20μl 反应体系中于 16℃ ，使 Hind Ⅲ 切过的  DNA （300μg/ml，0.12μM 5' 末端）在 30 分钟内连接 50% 所需的酶量为 1 个 NEB 单位。 1 NEB 单位等于 Weiss 单位， 1 Weiss 单位等于 67 NEB 单位。

50 五、影响连接酶效果的因素 1、酶切片段的状态 粘性末端连接效率比平端至少大100倍 5’突出粘性末端大于3’突出粘性末端 不同的限制性内切酶片段连接效率不同，以Hind III最好。

51 2、插入片段与载体的浓度比例： ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。 如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端为同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。

52 因此，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反应的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。 进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1：2～10，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。

53 3、反应温度： 37℃连接酶活性最高，但37℃时粘性末端DNA分子形成的配对极不稳定，故最佳12-16℃，最大限度地发挥连接酶的活性，又要有助于短暂配对结构的稳定。

54 4、反应液中的成分（特别针对平端连接）： 由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件： １）低浓度（0.5mmol/L）的ATP ２）不存在亚精胺一类的多胺。 ３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。 ４）高浓度的平端。

55 凝聚剂： 反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇或氯化六氨全高钴,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用： １）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。 ２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。

56 （１）聚乙二醇（PEG8000） １）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。 ２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2＋时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或MgCl2＋浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度。 ３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。 ４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

57 （２）氯化六氨合高钴 １）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为 μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的倍。 ２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。 ３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

58 六、连接酶使用时应注意事项: 1、二硫苏糖醇（DDT）用于保持酶的活性。在10倍浓缩的缓冲液中，DTT在冷冻时有可能析出。如果出现这种情况，将缓冲液涡旋，使沉淀重新溶解即可，对实验结果无影响。 2、为防止ATP和DTT的降解，缓冲液应小量分装，-20℃保存。

59 第三节 DNA聚合酶 一、聚合酶的种类： 1、依赖DNA的DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow fragment、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和修饰过的T7 DNA聚合酶 2、不依赖DNA的DNA聚合酶： 末端转移酶 3、依赖RNA的DNA聚合酶： 反转录酶

60 4、依赖DNA的RNA聚合酶： E.coli RNA聚合酶，phage SP6、T7和T3 RNA聚合酶 5、不依赖DNA的RNA聚合酶： polyA聚合酶

61 二、常用的DNA聚合酶的特点 1、共同特点： 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端 2、主要区别： 持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。

62 常用DNA聚合酶的特性比较

63 三、DNA聚合酶 1、DNA聚合酶I：聚合酶活性：5’ 3’，需要引物 外切酶：5’ 3’ 3’ 5’校正功能 应用：缺平移探针标记

64 DNA聚合酶I反应条件：

65 2、Klenow fragment： 聚合酶活性：5’ 3’，需要引物 外切酶：3’ 5’ 用途： A：末端标记法 B：合成cDNA的第二链 C：随机引物（6nt）标记 D：末端终止法进行DNA序列分析

66 3、T4-DNA聚合酶 ： 聚合酶活性：5’ 3’， 外切酶：3’ 5’ 外切酶活性较klenow片段的活性大200倍，对单链DNA的活性大于双链DNA。 特点：当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。

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68 用途： A、填补或标记限制酶切割DNA后产生的凹缺3’ B、末端标记带3’突出末端的DNA： 利用3’ 5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端，再利用它的5’ 3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP C、标记用作杂交探针的DNA片段 D、将双链DNA的末端转化成平 E：体外诱变

69 4、T7-DNA聚合酶: 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： （1）T7基因5编码的大亚基：有5’3’聚合酶和3’  5’外切酶活性。 （2）大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性

70 T7 DNA聚合酶的特点： （1）持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 （2）3’5’外切酶活性高：单链和双链都能降解。 （3）不受DNA二级结构的影响：其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍。

71 T7-DNA聚合酶的用途： A、用填补或交换（取代）反应快速进行末端标记； B、将双链DNA的末端转化成平末端； C、复制较长的模板进行引物延伸反应，在测序中读出较长的序列。

72 5、修饰的T7DNA聚合酶 通过修饰使3’5’外切酶活性下降99%以上，但聚合能力不受影响，修饰后的T7DNA聚合酶在聚合反应中有很高的持续性；进一步改进的基因工程生产的测序酶2.0，完全没有核酸外切酶花性。 用途： （1）DNA序列分析，可读出较长的序列， （2）标记DNA 3’隐蔽末端和更有效地补平末端。

73 6、末端转移酶：罕见的DNA聚合酶：从小牛胸腺中纯化出的碱性蛋白质，催化单链或双链DNA分子的3’-OH末端添加一个至多个脱氧核苷酸的反应。
特点： （1）需要3’-OH和二甲胂酸缓冲液； （2）不需要模板！ （3）底物可以是单链DNA或是3’—OH突出的双链DNA，Co2+代替Mg2+下也可以作用于平末端。 （4）随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。

74 用途： （1）在载体或cDNA上加换互补的同源多聚尾，以便连接。 （2）标记DNA片段的3’末端 。 （3）快速扩增cDNA末端（Rapid  Amplification  of  cDNA  End简称为RACE）。

75 7、反转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）（Reverse transcriplase, RT）
种类： AMV-RT：鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV） M-MLV-RT:莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemin virus）反转录酶（M-MLV Reverse Transcriptase）

76 特性： 以RNA为模板，具有RT及RNaseH活性（核酸外切酶）。无3’5’ 外切酶校正功能，错配率较高。5’3’方向聚合酶活性，须有引物及模板分子， M-MLV反转录酶与AMV反转录酶相比缺乏连续性，因此要获得像AMV反转录酶反应中产生同样量的cDNA就要求使用较多单位的M-MLV反转录酶。用1微克的mRNA起始合成第一条链的cDNA，要用8单位的M-MLV反转录酶才相当于1单位的AMV反转录酶的作用。

77 RNaseH： 链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。
为了提高合成的cDNA完整性，现采用RNaseH-的RT。 用途： 合成cDNA。以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。

78 四、RNA聚合酶： 1、依赖DNA的RNA聚合酶 包括：E.coli RNA聚合酶，phage SP6、T7和T3RNA聚合酶 以DNA为模板，从启动子开始，经过延伸、终止，合成转录产物。 用途： A：合成单链RNA探针 B：体外翻译，基因表达分析

79 2、不依赖DNA的RNA聚合酶 ： 多聚（A）聚合酶，ATP存在下，催化在单链RNA3’末端加上AMP，任何RNA可作底物 。 用途： A：在RNA末端加上多聚（A）尾，以合成cDNA； B：标记RNA的3’端 。

80 第四节 修饰酶 修饰酶：主要为三类：末端转移酶（在DNA聚合酶中已述），碱性磷酸酶，多核苷酸激酶 一 T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase) 来源： T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。 2. 功能： 催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。

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83 （2）交换反应标记法

84 二、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）
碱性磷酸酶种类 （1）细菌性碱性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase，BAP） （2）小牛肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP） 2. 特性： BAP较CIP难失活，它对热、SDS等去活剂抗性较强，CIP在实验中较常用。5mM EDTA,65℃,1小时(75℃，10分钟)，可使CIP失活，再用酚/氯仿抽提纯化脱磷的DNA，除去CIP，也可用蛋白酶K降解，除去CIP可使连接效率更高。

85 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根

86 3. 用途： A：载体5’末端脱磷，防止载体自我环化。 B：在RNA/DNA末端除去5’磷酸，便于标记5’末端 。

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90 第五节 核酸外切酶（ Exonucleases）
是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。

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95 第六节 单链DNA内切酶

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98 用途： 1、SNP分析 2、用mRNA测定基因中的外显子序列

99 二、Bal 31核酸酶 1. 来源： 埃氏交替单胞菌（Alteromonoas espejiana） 2. 功能： 既有单链特异的DNA（RNA）内切酶； 又有双链特异的DNA外切酶。降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。

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104 RNase A：专一性作用于单链RNA，最终产物为带3’磷酸的嘧啶和末端为磷酸嘧啶的寡核苷酸。耐热性高，100℃，不失活。
用途：DNA纯化中，用来除RNA DNaseI：优先水解双链或单链DNA上靠近嘧啶核苷酸的位点，产生5’磷酸核苷酸和寡聚核苷酸的混合物 。

105 1. 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值。
当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位。 2. 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口