第六章           核 酸

的世纪 二十世纪是 物理学 二十一世纪是 生命科学 的世纪 生命是 ？ 生命 = 核酸 + 蛋白质 二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪

第一节 核酸概论  一、核酸的发现和研究简史

（deoxyribonucleic acid , DNA) 二、核酸的种类和分布 （一）脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid , DNA) 原核：裸露的DNA分子集中于核区 真核：细胞核DNA：与组蛋白、非组蛋白形成染色体 细胞器DNA：双链环形，一般裸露

（二）核糖核酸（ribonucleic acid , RNA) 1、转移RNA（transfer RNA , tRNA) : 保守性最强 2、核糖体RNA（ribosomal RNA , rRNA) 3、信使RNA（mesenger RNA , mRNA) 4、特殊功能的RNA Small nuclear RNA , snRNA Small nucleoar RNA , snoRNA Small cytoplasmic RNA , scRNA Antisense RNA Ribozyme RNase P

三、核酸的功能 （一）DNA是主要的遗传物质 1944 ， O. Avery 肺炎双球菌转化实验 1952 ， A.D Hershey 和M. Chase 噬菌体感染实验

（二）RNA功能的多样性 1、参与蛋白质的合成 2、RNA的转录后加工与修饰 3、参与基因表达的调控 4、生物催化作用

第二节 核酸的结构

一、核酸的化学组成 核 酸（nucleic acid) 核苷酸(nucleotide) 核苷(nucleoside) 磷酸 (phosphoric acid) 核苷(nucleoside) 戊糖(pentose) 碱基(base)

P479 表13-1 两类核酸的基本化学组成 RNA： D-核糖， A、G、C、U碱基 DNA： D-2-脱氧核糖， A、G、C、T碱基

3. 核酸中的修饰碱基： 100余种，多数是甲基化的产物 （一）、  碱基 P479 结构式 1.嘧啶碱：尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶 2.  嘌呤碱： 腺嘌呤 鸟嘌呤  嘌呤衍生物 ： 3. 核酸中的修饰碱基： 100余种，多数是甲基化的产物 P479 表13-2 核酸中的稀有碱基

（二）、  核苷与脱氧核苷 1、基本核苷 P480 结构式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脱氧核苷

★嘧啶碱： C1 —N1，嘌呤碱： C1 —N9。 ★核酸中的核苷与脱氧核苷均为β-型 ★碱基平面与核糖平面互相垂直

2、核酸中的稀有核苷 ★稀有碱基 ★稀有糖苷键：假尿嘧啶核苷（ψ）P481 ★甲基化核糖

（三）、  核苷酸 核苷中戊糖C2 、C3、C5羟基被磷酸酯化 P481结构式：5’-AMP 3’-dCMP

1、   构成DNA、RNA的核苷酸 P481表13-4 DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMP RNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP

2、 细胞内的游离核苷酸及其衍生物 ①核苷5’-多磷酸化合物 ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG 2、   细胞内的游离核苷酸及其衍生物 ①核苷5’-多磷酸化合物 ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG 在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。 ②环核苷酸 3’,5’-cAMP， 3’,5’-cGMP 信号分子，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。 ③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物 ppGpp pppGpp ppApp ④核苷酸衍生物 HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。 GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。

二、 DNA的结构 一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。 二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的 双螺旋结构。

（一）、 DNA的一级结构 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸 P482 图13-1磷酸二酯酶对核酸的水解作用 ★DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’、5’-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体。 P483 图 13-2DNA中多核苷酸的一个片段及缩写符号  

写法：5’→3’： 5’-pApCpTpG-3’，或 5’…ACTG…3’

★ DNA一级结构的不均一性 （1）重复序列 ★正向重复(? repeat) ★反向重复（回文序列） (inverted repeat , palindrome sequence) 较长的回文结构，可形成茎环结构(发夹结构)或十字形结构 较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。 转录的终止作用与回文结构有关。 ★镜象重复（mirror repeat) 某些情况下可以三股螺旋DNA

★高度重复序列 （high repetive sequence, satelite DNA，SSR) 2-10bp/copy 105-106 copies/genome 多为串联重复排列（tandem repeats) 分布于着丝点、端粒区、结构基因两侧 ★中度重复序列（middle repetitive sequence) 0.1-1Kb/copy 10-104 copies/genome 多为间隔重复 rDNA\tDNA\Histone gene cluster ★低拷贝重复：基因家族 ★单拷贝序列（single copy sequence)

（2） 富含AT的序列 很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。

（二）、  DNA的二级结构 1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。

★Chargaff 规律 1950年 a. 所有生物的DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。 P485表13-5。 b. DNA的碱基组成具有种的特异性。 c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。 d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。

★ DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。 Franklin

1、 Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA) P486图13-5 ★ 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’ ★ 磷酸与脱氧核糖彼此通过3‘、5‘-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。 ★磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。 ★碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行 ★ 两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。 ★螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持 ★ 每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距离0.34nm，双螺旋平均直径2nm， ★大沟：宽1.2nm ，深0.85nm， 小沟 ：宽0.6nm，深0.75nm

★ 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’

★ 磷酸与脱氧核糖彼此通过3‘、5‘-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。 ★磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。

★碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行 ★ 两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。 ★螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持

★ 每圈螺旋10.4nt ，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2nm，

2、稳定双螺旋结构的因素 ①碱基堆积力形成疏水环境（主要因素） 。 ②碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。 ③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。 ④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。

3、  DNA二级结构的多型性 P489表13-6 A-、B-、Z-DNA的比较 相对湿度92%：B—DNA 相对湿度75%：A—DNA。

（1）   B—DNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA 右手双螺旋 每圈螺旋10.4个碱基对 螺距：3.32nm （2）  A-DNA 右手双螺旋，外形粗短。 RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 （3）Z-DNA 左手螺旋，外形细长。 天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。

oligo(Py) : oligo(Pu)—oligo(Py/Pu) （4） 三股螺旋DNA K. Hoogsteen 1963 通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合： oligo(Py) : oligo(Pu)—oligo(Py/Pu)

★第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤

★第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对 P489 图13-10 三股螺旋DNA中的Hoogsteen-bonding T= A : A , C≡G ： C+ T = A : T C≡G ： G

★当DNA的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋（铰链DNA，hinged DNA , H-DNA) P 490 图13-11 H-DNA的结构

★DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。 第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。

(三）、 DNA的三级结构 DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象 ★超螺旋是DNA三级结构的主要形式

1、 环状DNA的三种典型构象 P491 图13-12 （1）、 松弛环形DNA （2）、 解链环形DNA

MOV : PBC\A0267501\supercoiling of DNA

2、 三种环形DNA的拓扑学特性

①连环数（linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 ②扭转数（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示 ③超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W） L=T+W 连环数（L） 缠绕数（T） 扭曲数W 松驰环 25 解链环 23 超螺旋 -2

④比连环差（specific linking difference , λ） 表示DNA的超螺旋程度(Superhelix density) λ=（L—L0）/L0 = 每一圈初级螺旋（10bp，360°）出现超螺旋数 L0是指松驰环形DNA的L值

一般天然DNA分子中σ=-0.05=5%负向超螺旋 SV40 5226bp T=522 W=-26(L=496) σ=-0.05 E.coli 4.2X106bp T=4.2X105 W=4.2 X 105 X - 0.05=-2X104 负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等

3、 拓扑异构酶 改变DNA拓扑异构体的L值。 ①拓扑异构酶酶I（解旋酶） 3、   拓扑异构酶 改变DNA拓扑异构体的L值。 ①拓扑异构酶酶I（解旋酶） 能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每次催化使L值增加1。 ②拓扑异构酶酶II（促旋酶） 能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2。

4、染色体的结构 （1）、整个病毒可以看成游离的染色体 组成：核酸、蛋白、脂类、糖类 基因组：单链或双链的DNA（或RNA），多数环状 形状：丝状、多面体状、 P493 图13-13 一些噬菌体的结构

（2）、细菌染色体的结构—— （拟核，nucleoid) 细菌基因组多数为双链环状DNA ，与碱性蛋白、RNA结合，形成带有无数突环的刷状染色体 P494 图13-15 细菌的拟核结构

（3）、真核生物染色体的结构 染色质、染色体 常染色质、异染色质 永久性异染色质、功能性异染色质 核小体（nucleosome):146bp, 组蛋白：H2A、H2B、H3、H4 P495 图13-17真核生物染色体DNA的组装层次

MOV：MCB4.0\three dimensional packing of nuclear chromosomes

三、   RNA的结构

（一）、 RNA的一级结构 P483 AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体。   P484 图13-3 RNA分子中的一段结构

①    组成RNA的戊糖是核糖 ②    RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。 ③    天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。

（二）、 tRNA的结构 P496 三叶草形的二级结构 497 倒L形的三级结构 ★ 70-90b，分子量在25kd左右，沉降系数4S左右 ★有较多稀有碱基 ★3’末端为…CCA-OH ★ 5’末端大多为pG…或pC… ★二级结构是三叶草形 ★倒L形的三级结构   P496 三叶草形的二级结构 氨基酸臂 二氢尿嘧啶环 反密码环 额外环 TC环（假尿嘧啶环） 497 倒L形的三级结构

★tRNA的功能： ●转运氨基酸 ●识别密码子 ●参与翻译起始 ●参与DNA的反转录 ●参与基因表达调控

（三）、  mRNA的结构 原核：多顺反子（polycistronic mRNA) 真核：单顺反子，断裂基因（splited gene)

1、   真核mRNA的结构 P484 图13-4真核mRNA的结构

★ 5’-帽子：m7G 5’ -ppp5’-Nm（ Nm ）p- 甲基鸟苷5’，5’-三磷酸 O型： m7G 5’ -ppp5’-Np- I： m7G 5’ -ppp5’-Nmp-Np- II: m7G 5’ -ppp5’-Nmp -Nmp -Np-

●由甲基化酶催化 ●可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。 ● 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。

★  3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。 ●转录后由poly(A)聚合酶催化加尾 ●PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。 ●polyA与mRNA半寿期有关， PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。

2、 原核mRNA的结构（多顺反子） ★由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5’帽子和3’polyA。 ★SD序列：5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。 ★SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补。

（四）、 rRNA的结构 小亚基 大亚基 转录单位 原核 16 5 23 30 真核 18 5（单独转录） 28 5.8 5 + 45 细菌： 16S rRNA 、5S rRNA、23S rRNA组成30S转录单位 真核：18SrRNA、 5.8S rRNA，28S rRNA组成45S的转录单位，5S rRNA单独转录。 小亚基 大亚基 转录单位 原核 16 5 23 30 真核 18 5（单独转录） 28 5.8 5 + 45

P498 图13-20 16S、5S rRNA的结构 大肠杆菌 5S rRNA 结构

★rRNA的功能： ●组成核糖体 ●催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上 ●参与tRNA与mRNA的结合

第三节   核酸的物理化学性质

一、核酸的水解 自学

（一）酸水解 ★对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 ★脱嘌呤： pH1.6，37℃，对水透析 pH2.8，100℃，1h ★脱嘧啶： 98-100%甲酸，175℃，2h 三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或80min（RNA） ★利用酸水解可以研究核酸的碱基组成

（二）、   碱水解 ★RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.3~1mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。 ★DNA抗碱水解 ★生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。

（三）、 酶水解 ★特异的磷酸二酯酶：核酸酶 ★非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸 （三）、   酶水解 ★非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸 ★特异的磷酸二酯酶：核酸酶

1、核酸酶的分类 ★底物专一性： ★作用方式： ★磷酸二酯键的断裂方式： 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase 核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 ★磷酸二酯键的断裂方式： 5’-（寡）核苷酸 3’-（寡）核苷酸

2、RNAase ★RNase H ★RNase T1 ★RNase T2 作用于DNA-RNA中的RNA链 ★牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶 ★RNase T1 耐热、耐酸 产物：以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高 ★RNase T2 产物：以3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸

3、DNase ★核酸酶S1 ★牛胰核糖核酸酶，DNase I ★DNA限制性内切酶 作用于单链DNA部分 切断双链或单链DNA 产物：以5’-磷酸为末端的寡核苷酸 ★DNA限制性内切酶

4、N-糖苷酶

二、  核酸的酸碱性质 选学 磷酸和碱基均能发生两性解离。 DNA等电点 4—4.5 RNA 等电点 2—2.5

1、碱基的解离 P504

2、核苷的解离 P505

3、核苷酸的解离 P506表14-1 某些碱基、核苷、核苷酸的解离常数

4、核酸的滴定曲线 P507 图14-1 核苷酸的滴定曲线 P507 图14-2 小牛胸腺DNA的滴定曲线

三、  核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260nm

1、   鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、   含量计算 1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）

四、  核酸的变性、复性及杂交

(一)、   变性 ★核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 P508 图14-4DNA变性过程

 ★变性因素 ： 热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） ★变性后的理化性质 ： 260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。

★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 ★   增色效应与减色效应 增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。

1、 熔解温度（Tm）： ★DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82—95℃之间

2、 影响DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性 。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。

②G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44 P509图5-19 图14-5 Tm值与GC含量的关系

③介质中离子强度 离子强度高，Tm高。 P509 图14-6

(二)、   复性 变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。

★复性机制：10-20bp成拉链 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 ★DNA片段越大，复性越慢； ★DNA浓度越大，复性越快。 ★复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。

P352 图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。

●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数 ●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0m mol/L，则 50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 全部复性， Cot=10-4， t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则 复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。 复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天。 ●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数

(三) 分子杂交

1、 Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜，尼龙膜） 固定（80℃，4-6h） 杂交（高盐浓度，68℃，几小时） Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。

2、 Northern Blotting 3、 Western Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 3、   Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。

第四节   核酸研究技术

一、  核酸的分离纯化和定量 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。

（一）、   DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀

（二）、RNA的制备 ★RNase 的灭活： 玻璃器皿：140-200，8 塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂

★用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白 ★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法 ★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法 蛋白质：＜1.33g/ml DNA：1.71g/ml左右 RNA：＞1.89g/ml ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法

（三）、核酸的定量 P514 紫外分光光度法 定磷法 定糖法

二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来 这一方法常用于质粒DNA的纯化。

（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度： 8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10 ρ ：浮力密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离

（二）密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10 但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。

（三）密度梯度超速离心研究核酸的构象 RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大

（四）密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象 的DNA

三、  核酸的凝胶电泳 （一）、   琼脂糖电泳 用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广

★影响迁移率的因素： ① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 ②    凝胶浓度 ③ DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。 ④    电压，不大于5V/cm ★染色：0.5ug/ml EB ★ RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛

★琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定 ★琼脂糖电泳可以用于DNA的制备与纯化

（二）、   PAGE电泳 用于小片段DNA的分析，精度非常高

四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建 （1979年发现） (一)、 限制修饰系统 (一)、   限制修饰系统 限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA

(二)、   II型限制性核酸内切酶 限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。

★II型酶的切割频率 识别位点 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536   ★限制酶的命名：E.coRI 第一位： 属名E（大写） 第二、三位：种名的头两个字母小写co 第四位： 菌株R 第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号

★同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。   BamHI：GG↓ATCC BstI GG↓ATCC MboI GAT↓C Sau3A GAT↓C ★同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。 BclI TG↓ATCA BglII AG↓ATCA

★星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。   例如 HindIII AAG↓CTT

(三)、 DNA物理图谱及构建 （限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱） 在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。 ★末端标记法构建DNA物理图谱： （1）单酶完全降解和部分降解 （2）双酶降解

五、 DNA序列分析 （一） 双脱氧终止法 英国 Sanger （一）      双脱氧终止法 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。

MOV : MCB4.0\Dideoxy sequencing of DNA

DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP

（二） 化学裂解法 Maxam-Gilbert ， 1977 原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影得到侧序图谱。 32P-GCTACGTA： 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG

G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸/哌啶 C反应：肼/NaCl/哌啶 C+ T：肼/哌啶 哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂

32P *ACTTCGACAG 肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼（C+T）： *ACT *ACT T *ACTTCGAC 硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG *ACTTCGACAG 甲酸（G+A）： *A *ACTTCGA *ACTTCGACA 从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。

（三） RNA的侧序 （1）酶裂解法 胰RNase A：嘧啶结尾 米曲霉RNase T1：鸟苷酸结尾 黑粉菌RNase U2：腺苷酸结尾 （1）酶裂解法   胰RNase A：嘧啶结尾 米曲霉RNase T1：鸟苷酸结尾 黑粉菌RNase U2：腺苷酸结尾 多头黏菌RNase Phy I：A、G、U结尾

（2）化学裂解法 （3）逆转录成cDNA法

六、  DNA聚合酶链式反应——PCR

MOV:MCB4.0\POLYMERASE CHAIN REACTION ①模板DNA（单链） ②引物 ③DNA聚合酶（Taq） ④dNTP ⑤Mg2+ MOV:MCB4.0\POLYMERASE CHAIN REACTION

P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA   P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA 合成方向：3’ → 5’端 5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3’-OH用氨基亚磷酸化合物活化 碱基上氨基用苯甲酸保护