Regulation of Gene Expression Chapter 13 基因表达调控 Regulation of Gene Expression 主讲：张维娟 副教授 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 教研室

主要内容 §1.基本概念与原理 §2.基因表达调控的基本原理 §3.原核基因表达调节 §4.真核基因表达调节 基因表达的概念、特异性、方式及生物学意义 §2.基因表达调控的基本原理 基因表达的多层次和复杂性 基因转录激活调节基本要素 §3.原核基因表达调节 原核基因转录调节特点 原核生物转录起始、转录终止和翻译水平调节 §4.真核基因表达调节 真核基因组结构特点 真核基因表达调控特点 转录起始、终止、转录后及翻译水平的调节

Basic Conceptions and Principle 第 一 节 基本概念与原理 Basic Conceptions and Principle 基因表达的概念 基因表达的特异性 基因表达的方式 基因表达调控的生物学意义

一、基因表达的概念 * 基因(gene) DNA * 基因表达(gene expression) 翻 译 mRNA 多肽 结构基因 转 录 tRNA 无翻译产物 无转录产物 rRNA 调节基因 * 基因表达(gene expression) 基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。

人的23对染色体 * 基因组(genome) 生物体所携带的全部遗传信息或整套基因。 绝大部分生物体基因组:双链DNA 病毒基因组:双链或单链DNA或RNA。 不同生物基因组所含基因数目不同。 基因组的大小用全部核苷酸序列的碱基对总数表示。 例如：哺乳动物基因组DNA：3109bp 人的23对染色体

﹡基因表达调控（gene expression regulation and control） 指通过生物体内的调控系统来调节和控制体内蛋白质的含量与活性，使之在特定的时间、特定的空间、并以一定的强度出现，以适应机体生长、发育和繁殖的需要。

DNA损伤 紫外光照射 光修复酶基因 光修复酶

二、基因表达的特异性 （一）时间特异性 A B 在生物体不同的功能阶段，按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性(temporal specificity)。 A B

（二）空间特异性 在个体生长、发育全过程，某种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同组织空间出现，称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity)。 A B C 基因表达伴随时间或阶段顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。

三、基因表达的方式 （一）组成性表达 管家基因 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。 （一）组成性表达 管家基因 无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，几乎在生命的全过程和生物体的所有细胞中持续表达。这类基因表达被视为组成性(或基本)基因表达(constitutive gene expression)。

（二）诱导和阻遏表达 表达增强 表达减弱 协调表达 环境信号 诱导 阻遏 在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。该过程称为诱导(induction)。 如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。 环境信号 表达增强 诱导 表达减弱 阻遏 协调表达

在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达(coordinate expression) 这种调节称为协调调节(coordinate regulation)。

四、基因表达调控的生物学意义 （一）适应环境、维持生长和增殖 （二）维持个体发育与分化

第二节 基因表达 调控的基本原理

一、基因表达的多层次和复杂性 基因激活 转录起始 转录起始 转录后加工 mRNA降解 蛋白质降解等 蛋白质翻译 翻译后加工修饰

二、基因转录激活调节基本要素 特异DNA序列 调节蛋白 RNA聚合酶 基因表达的调节与基因的结构、性质，生物个体或细胞所处的内、外环境，以及细胞内所存在的转录调节蛋白有关。 特异DNA序列 调节蛋白 DNA -蛋白质、蛋白质-蛋白质的相互作用 RNA聚合酶

原核生物 (一)特异DNA序列 —— 操纵子(operon)机制 特异DNA序列 编码序列 启动序列 操纵序列 其他调节序列 蛋白质因子 (promoter) (operator) 蛋白质因子

1)启动序列 是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。 -35区 -10区 trp lac recA 共有序列 RNA转录起始 TTGACA TTAACT TTTACA TATGAT TATGTT TTGATA TATAAT CTGACG TACTGT N17 N16 N7 N6 A trp tRNATyr lac recA Ara BAD 共有序列 共有序列(consensus sequence)决定启动序列的转录活性大小。

pol 启动序列 编码序列 操纵序列 2 操纵序列 ——阻遏蛋白(repressor)的结合位点 当操纵序列结合有阻遏蛋白时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移动 ，阻碍转录。 pol 阻遏蛋白 启动序列 编码序列 操纵序列

3) 其他调节序列 例如: 激活蛋白(activator)可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。 有些基因在没有激活蛋白存在时，RNA聚合酶很少或完全不能结合启动序列。

真核生物 编码序列 顺式作用元件(cis-acting element) ——可影响自身基因表达活性的DNA序列 转录起始点 B A DNA 不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一些共有序列 ，如TATA盒、CAAT盒等，这些共有序列是RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。

根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核生物基因的这些功能元件分为： 启动子 增强子 沉默子

(二) 调节蛋白 原核生物 特异因子 阻遏蛋白 激活蛋白 特异因子 决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列 的特异性识别和结合能力。 CAP 启动序列 操纵区 转录起始 阻遏蛋白 激活蛋白 特异因子 决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列 的特异性识别和结合能力。 阻遏蛋白 识别、结合操纵序列,阻遏基因转录 激活蛋白 与启动子附近DNA结合,促进RNA聚 合酶与启动区结合，增强转录活性 DNA结合蛋白

分解代谢物基因激活蛋白(catabolite gene activator protein,CAP) CAP与CAP位点结合后，才能促使RNApol与启动子结合，启动基因转录，这样一个操纵子中的一组基因就有两道开关，只有两道开关同时打开时基因才能转录。

真核生物 转录因子 反式作用因子(trans-acting factor) 反式作用 顺式作用 P 顺式作用蛋白

(三)DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质的相互作用 反式作用因子 通常是非共价结合 P 顺式作用元件 绝大多数调节蛋白质结合DNA前，需通过蛋白质-蛋白质相互作用，形成二聚体(dimer)或多聚体(polymer)。 蛋白质-蛋白质相互作用 P

1.原核启动序列/真核启动子与RNA聚合酶活性 -35: T82G78A65C54A95 -10: T80A95T45A60A50T96 2.调节蛋白与RNA聚合酶活性 一些特异调节蛋白在适当环境信号刺激下表达，然后通过DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性。

基因激活、转录起始、转录后加工、 mRNA降 小结: 一、多级调控： 基因激活、转录起始、转录后加工、 mRNA降 解、蛋白质翻译、翻译后加工、蛋白质降解 二、基因转录激活调节基本要素 (一) 特异DNA序列 原核生物—操纵子（operon） 启动序列 操纵序列 编码序列 调控区

真核生物—顺式作用元件 (二) 调节蛋白 原核生物：特异因子（识别启动序列） 启动子 增强子 沉默子 阻遏蛋白（结合操纵序列） 启动子 增强子 沉默子 (二) 调节蛋白 原核生物：特异因子（识别启动序列） 阻遏蛋白（结合操纵序列） 激活蛋白（与启动子附近DNA结合） 真核生物：转录因子 （反式作用因子和顺式作用蛋白）

(三) DNA–蛋白质、蛋白质–蛋白质相互作用 反式作用因子与顺式作用元件特异识别和结合 蛋白质之间相互作用可直接或间接结合DNA (四) RNA聚合酶 启动子序列的差别决定RNA聚合酶的活性 调节蛋白影响RNA聚合酶的活性

Regulation of Prokaryotic Gene Expression 第 三 节 原核基因表达调节 Regulation of Prokaryotic Gene Expression

一、原核基因转录调节特点 （一）σ因子决定RNA聚合酶识别特异性 （二）操纵子模型的普遍性 （三）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性 ——调节的主要环节在转录起始 一、原核基因转录调节特点 （一）σ因子决定RNA聚合酶识别特异性 （二）操纵子模型的普遍性 （三）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性

二、原核生物转录起始调节 Z Y A O P （一）乳糖操纵子(lac operon)的结构 调控区 结构基因 DNA Z：β-半乳糖苷酶 CAP结合位点 启动序列 操纵序列 结构基因 Z：β-半乳糖苷酶 Y：透酶 A：乙酰基转移酶 Z Y A O P DNA

操纵子模型的提出 获1965年诺贝尔生理学和医学奖 操纵子模型的提出 获1965年诺贝尔生理学和医学奖 François Jacob, 1965 Jacques Monod, 1965 1961年，Jacob和Monod提出了操纵子学说(lac operon)，开创了基因表达调节研究的新领域。

（二）乳糖操纵子调节机制 1.阻遏蛋白的负性调节 阻遏基因 pol I DNA Z Y A O P mRNA 阻遏蛋白 没有乳糖存在时

pol I DNA Z Y A O P mRNA 阻遏蛋白 mRNA 启动转录 β-半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 有乳糖存在时

IPTG(异丙基硫代半乳糖苷) 极强的诱导剂

Z Y A O P 2. CAP的正性调节 + + + + 转录 DNA CAP 无葡萄糖，cAMP浓度高时 CAP CAP

结论：lac 操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖 3.协调调节 ※当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用； ※如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。 乳糖操纵子结构基因转录需具备两个条件： ① 阻遏蛋白与操纵基因解离 ② CAP与CAP结合位点结合 结论：lac 操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖

低半乳糖时 高半乳糖时 葡萄糖低 cAMP浓度高 RNA-pol O O mRNA 葡萄糖高cAMP浓度低 O O

三、原核生物转录终止调节 转录终止机制：依赖因子的转录终止 不依赖因子的转录终止 E.coli 存在两种终止调节方式： 衰减和抗终止 色氨酸操纵子的转录衰减作用是通过操纵子前导区内存在的类似终止子结构的一段DNA序列实现的，这段DNA序列称为衰减子。

转录衰减 调节区 结构基因 RNA聚合酶 P O trpR RNA聚合酶 Trp 低时 mRNA Trp 高时 ? Trp 色氨酸操纵子

O P 前导序列 trp 密码子 调节区 结构基因 衰减子区域 UUUU…… 前导mRNA 终止密码子 UUUU…… 14aa前导肽编码区: trpR O P 衰减子区域 前导序列 UUUU…… 前导mRNA 1 2 3 4 trp 密码子 终止密码子 UUUU…… 14aa前导肽编码区: 包含序列1 衰减子结构 第10、11密码子为trp密码子 UUUU…… UUUU…… 形成发夹结构能力强弱： 序列1/2>序列2/3>序列3/4

转录衰减机制 3 4 前导DNA UUUU 3’ 前导mRNA 终止 核糖体 UUUU 3’ UUUU…… trp 密码子 前导肽 衰减子结构 就是终止子 可使转录 3 4 终止 核糖体 UUUU…… 3 4 1 2 5’ UUUU 3’ trp 密码子 前导肽 1.当色氨酸浓度高时

3 4 Trp合成酶系相关 结构基因被转录 前导DNA 结构基因 前导mRNA 核糖体 UUUU…… UUUU…… 2 3 UUUU…… 核糖体 UUUU…… 3 4 2 1 5’ trp 密码子 序列3、4不能形成衰减子结构 前导肽 2.当色氨酸浓度低时

意义：这种机制可以保证充分地消耗色氨酸，使其合成维持在满足需要的水平，防止色氨酸堆积和过多地消耗能量。同时，也使细菌能够优先将环境中的色氨酸消耗完，然后开始自身合成。 36

四、原核生物翻译水平调节 （一）蛋白质分子的自我调节 调节蛋白-----自身的RNA （二）反义RNA对翻译的调节 调控蛋白一般作用于自身mRNA,抑制自身的合成,这种调节方式称自我控制(autogenous control) （二）反义RNA对翻译的调节 调节RNA-----反义控制 反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子。 反义控制(antisense control) ------是指反义RNA抑制翻译起始的调节。

小结: 原核基因转录调节 一、特点 因子决定转录特异性 操纵子模型------多顺反子 阻遏蛋白调节 二、乳糖操纵子调节机制 结构：调控区：P、O和CAP结合位点 结构基因： Z 、Y 、A 调节：阻遏蛋白的负性调节 CAP的正性调节 协调调节

Regulation of Eukaryotic Gene Expression 第 四 节 真核基因表达调节 Regulation of Eukaryotic Gene Expression

一、真核基因组结构特点 （一）真核基因组结构庞大 哺乳动物基因组DNA：3109 bp 结构基因：6% 重复基因：5%---10% 其它：80%---90%

（二）单顺反子 （三）重复序列 （四）基因不连续性 单顺反子(monocistron) 即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链。 （三）重复序列 单拷贝序列（一次或数次） 高度重复序列（106 次） 中度重复序列（103 ~ 104次） 多拷贝序列 （四）基因不连续性

（三）重复序列 高度重复顺序， 中重复顺序 低重复或单拷贝顺序。 重复序列有种族特异性，基因组愈大，重复序列含量愈丰富。

重复DNA可分为： 高度重复顺序，中重复顺序和低重复或单拷贝顺序。

根据重复单位碱基顺序：正向重复、反向重复 AGGT AGGT AGGT NNNNNNN AGGT ACTT TTCA ACTT NNNNNNN TTCA ACGG CCGT TGCC GGCA ACGG NNNNNNN CCGT TGCC NNNNNNN GGCA

（四）基因不连续性 基 因 启动子 终止子 转录区 初级RNA转录本 ATG TAA 5’ 3’

外显子 内含子 特点： 在真核生物中具有普遍性。 内含子长度大于外显子。 包括蛋白质基因和RNA基因。

二、真核基因表达调控特点 （一）RNA聚合酶 （二）活性染色体结构变化 （三）正性调节占主导 （四）转录与翻译分隔进行 （五）转录后修饰、加工

活性染色体结构变化 1. 对核酸酶敏感 2. DNA拓扑结构变化 正超螺旋 负超螺旋 活化基因常有超敏位点，位于调节蛋白结合位点附近。 对DNase Ⅰ的敏感性增高 活化基因常有超敏位点，位于调节蛋白结合位点附近。 2. DNA拓扑结构变化 天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在； 基因活化后: RNA-pol 正超螺旋 负超螺旋 转录方向

3. DNA碱基修饰变化 4. 组蛋白变化 真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化， 甲基化范围与基因表达程度呈反比。 CpG岛 真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化， 甲基化范围与基因表达程度呈反比。 4. 组蛋白变化 磷酸化和乙酰化 ① 富含Lys组蛋白水平降低 (H1样组蛋白减少) ② H2A, H2B二聚体不稳定性增加 ③ 组蛋白修饰 (修饰后使核小体结构变得不稳定)

三、RNA聚合酶I 和 III 转录调节 RNA聚合酶有三种：I，II，III； 都由多个亚基组成； 各型都专一性转录出不同的RNA产物。 I型： 45 S-rRNA II型： hnRNA III型： 小分子RNA（5S-rRNA，tRNA，snRNA）

（一）RNA聚合酶I 转录体系控制 rRNA前体转录单位的成簇排列 启动子: 核心元件(-45--+60bp) 上游控制元件(-156---107bp)--UCE 调控因子 上游结合因子 选择性因子

（二）RNA聚合酶III 转录体系控制 III型： 5S-rRNA，tRNA，snRNA 内部控制区(ICR) ----启动子位于转录起始点下游转录区内 tRNA的ICR: A盒, B盒----TFⅢC和TFⅢB 5SrRNA ： TFⅢ A，TFⅢC和TFⅢB

四、真核基因RNApolⅡ转录激活调节 （一）顺式作用元件 1 启动子(promoter)：RNA聚合酶结合位点及周围的一组转录 控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件 2 增强子(enhancer)：远离转录起始点、决定基因的时间空间 特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列。其发挥作用的 方式通常与方向、距离无关。 3 沉默子(silencer)：对基因转录起阻遏作用的负性调控元件 。 TATA盒 GC盒 CAAT盒 增强子 沉默子 启动子 E S P 结构基因 顺式作用元件

沉默子 抑制基因转录 增强基因转录水平 与增强子对应，沉默子抑制基因的表达。 增强子和沉默子的概念并不是绝对的，一个DNA元件可以是增强子也可以是沉默子。 沉默子 抑制基因转录 甲状腺激素受体 增强子 增强基因转录水平 甲状腺素

感染真核细胞的病毒DNA，大多具有可被寄主细胞蛋白质激活的增强子。 小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）的DNA，具有糖皮质激素基因的增强子。在能被类固醇激活的细胞（如乳腺上皮细胞）中，MMTV病毒能旺盛生长。 病毒有寄主范围，因它有组织特异和物种特异的增强子。

（二）反式作用因子（转录调节因子） 1 转录因子分类（按功能特性） 基本转录因子(general transcription factors)：是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白质因子。 特异转录因子(special transcription factors)：为个别基因所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。分为转录激活因子和转录抑制因子。 反式作用因子 E S P

2. 转录调节因子结构 亮氨酸拉链 锌指 碱性α-螺旋 DNA结合域 转录激活域 TF 谷氨酰胺富含域 酸性激活域 脯氨酸富含域 蛋白质-蛋白质结合域 （二聚化结构域） 亮氨酸拉链 螺旋-环-螺旋

最常见的DNA结合域： ⑴ 锌指(zinc finger) C —— Cys H —— His (常结合GC盒) DNA结合域中由2个Cys和2个His与一个锌离子借配位键结合成的指状结构。如类固醇激素受体家族有2个锌指结构 C —— Cys H —— His

Cys Zn His

1 2 3 表示锌离子

如CTF是结合CAAT盒的一种转录因子，其DNA结合域具有-螺旋，并富含碱性氨基酸。 ⑵ 碱性α-螺旋 常结合CAAT盒

⑶螺旋-环-螺旋 如:能与免疫球蛋白链基因增强子结合的反式因子E12和E47羧基端100~200aa可形成两个-螺旋， 两螺旋之间为非螺旋的环， -螺旋氨基端有碱性区，这个碱性区对结合DNA是必须的， -螺旋对形成二聚体是必须的。

⑷亮氨酸拉链(Leucine zipper) 结构特点: 蛋白质分子的肽链上有一段高度保守的序列，N-端富含碱性氨基酸，形成DNA结合面，羧基端能形成-螺旋,每隔6个氨基酸残基有规律的出现一个亮氨酸，导致亮氨酸出现在螺旋的同一侧，称为亮氨酸拉链区。两个具有亮氨酸拉链区的螺旋以非共价键相互作用，形成稳定的亮氨酸拉链。 如：C/EBP家族蛋白质，既能与CAAT盒结合，又能与病 毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结构。

亮氨酸拉链(leucine zipper) 亮氨酸拉链并不直接结合DNA，肽链氨基端20~30个富含碱性氨基酸的结构域与DNA结合，若不形成二聚体，这个碱性区对DNA的亲和力显著降低，因而DNA结合域以碱性区和亮氨酸拉链结构的整体作为基础，即bzip

亮氨酸拉链： 这类蛋白以二聚体形式与DNA结合 两分子-螺旋的亮氨酸一侧是形成二聚体的基础

（三）mRNA 转录激活及其调节 DNA 真核RNA聚合酶Ⅱ在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物 TF Ⅱ D 是唯一具有位点特异的 DNA 结合能力的转录因子，在上述有序的组装过程起关键性指导作用。 TBP相关因子 polⅡ TFⅡF TAF TAF TAF TFⅡH TBP TFⅡA TFⅡB TATA DNA 真核RNA聚合酶Ⅱ在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物

真核基因转录调节是复杂的、多样的 *不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式； *多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件。 *转录因子与DNA元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。

五、RNApolⅡ转录终止的调控 3加尾 RNA-pol 3 RNApolⅡ转录停止于polyA添加点以下0.5~2kb范围内多处可能位点，而不是想象中的理应在polyA添加点以上。 5 ------AAUAAA-- AAAAAAA······ 3 mRNA 3加尾 5------AAUAAA- 核酸酶 -GUGUGUG RNA-pol 5 3 5 AATAAA GTGTGTG 3 转录终止的修饰点

(一)HIV基因组转录终止的调控 (二)HSP基因转录终止的调控 HIV的Tat蛋白是一抗终止蛋白，它可使RNApolⅡ通过转录终止点，阻止基因组转录过程的提早终止。 (二)HSP基因转录终止的调控 正常情况下，RNApolⅡ起始HSP基因转录后只合成约25个核苷酸即停止，热休克时（环境温度升高或其它应激条件下），热休克转录因子（HSTF）快速地由无活性转变为活性状态，与HSP基因启动子的特异序列(HSRE)结合，使RNApolⅡ由停顿处释放而继续向下游转录，HSTF的结合不仅起抗终止作用，还能激活另外的RNApolⅡ的转录起始，因此HSTF同时也是激活蛋白。

六、转录后水平的调控 （一）hnRNA加工成熟的调节 (二) mRNA运输、胞浆内稳定性的调节 mRNA的运输是受到控制的。 mRNA通过核膜的运输是一个主动运输过程，核膜上的核孔是大约9-nm的通道，但可以运输大于9nm的颗粒，如核糖体（15nm）。核糖体均在核内组装，再运输到胞浆。RNA从核运输至胞浆的运输的调控机理目前还不清楚。

(iron-response element) 铁转运蛋白受体mRNA (TfR mRNA) 当[Fe++]↓时: 铁反应元件 IRE (iron-response element) TfR mRNA 寿命延长 结合 IRE结合蛋白(IRE-BP) IRE-BD的结合可能破坏了某些对TfR mRNA的 降解机制

RNA干涉(RNA interference)机制: dsRNA siRNA RNA诱导的沉默复合物 (RISC) 小分子RNA可调节真核基因表达 使mRNA降解 阻断翻译

七、翻译水平的调控 (一)翻译起始因子的活性的调节 (二)RNA结合蛋白对翻译起始的调节 elF-2活性因磷酸化而降低。 RNA结合蛋白:能够与RNA特异序列结合的蛋白质。 例如：铁蛋白、ALA合酶 [Fe2+]↓ IRE-BP 结合 抑制翻译起始 mRNA的 5’端有IRE IRE [Fe2+]↑ IRE-BP 不结合 翻译起始 IRE

重点： 基因表达调控的基本概念、特点、基本原理 原核基因表达调控的特点;原核生物乳糖操纵子的结构、负性调控、正性调控、协调调节 真核生物基因表达调控的特点、顺式作用元件和反式作用因子的概念、种类和特点，以及它们在转录激活中的作用。　　

- Finis and Thank you - And have a Happy New Year!