Lots of tools for cloning:

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1 Lots of tools for cloning:
Plasmid (BAC) Phagemid Cosmid Lambda (PAC)

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4 Needs to be at least 40kb to grow, but
A left and right arm can be made smaller… See next slide

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8 Intron and Exon in Eukaryotic Cells
DNA promotor intron 3’ 5’ start codon stop codon Transcription 5’ 3’ mRNA Processing cap poly A tail Splicing 真核細胞 的基因構造有一點與原核細胞差別很大，就是其基因當中，插入有將來不會被表現出來的片段，稱為 intron。 當轉錄 RNA 時，這些 intron 也會如數被合成出來，形成初生 RNA，後者先經 capping 及 polyA tail 的頭尾修飾，再以 spliceosome 切出 intron，得到成熟 mRNA，送出細胞核，以便在細胞質中轉譯蛋白質。 目前還不確知為何有 intron 的存在，但若以遺傳工程手法去除 intron，則此基因可能無法正常在原來的細胞核中表現。 Intron deleted mature mRNA To cytoplasm Take place in nucleus

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10 Eukaryotes Splice Signals
AG/GT CAG/NT exon intron exon 2

11 cDNA Is Reverse Transcribed from mRNA
Baltimore, Dulbecco, Temin (1975) mature mRNA 5’ 3’ poly A tail Reverse transcription TTTT 3’ 5’ RNA hydrolysis 3’ 5’ DNA polymerase 成熟 的 mRNA 是去除 intron 的全段基因，含有完整的基因信息；因此若以 mRNA 為模板，經逆向轉錄反應所得的 DNA，稱之為互補 DNA (cDNA)。 cDNA 可以群殖入載體，並且大量表現之；以全部 mRNA 所得的 cDNA 庫，含有所有正在表現中的基因。 cDNA 選殖株可以表現出蛋白質，因此可以用抗體篩選之。 3’ CCC 5’ 5’ GGG 3’

12 Reverse transcription
cDNA Library Genes in expression mRNA Reverse transcription Complete gene cDNA 基因庫 的建構依基因來源的不同而有兩種方法，其一是上述由 mRNA 所得的 cDNA 來建庫 (上圖左)，另一則由染色體 DNA 的限制脢片段來建庫 (上圖右)。兩者在基因庫大小與其用途上，有相當的差別，要依使用目的如何而做適當選擇。 許多常用的生物或細胞，都有已經建立好的基因庫出售，只要買回來篩選，即可得到所要的基因。 當然，自己必須準備好適當的探針。 上圖雖然都使用質體當作載體 (vector)，但是染色體基因庫中所攜帶的核酸片段都很大，因此多改用噬菌體基因，可以容納較長的片段。 Vector: Plasmid

13 Libraries: cDNA cDNA library has sequences only from genes transcribed into mRNA (~3% of genome)

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17 MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPWQFSMLAAYMFLLIML
GFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADLFMVFGGFTTTLYTSLH GYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMSNFRFGE NHAIMGVAFTWVMALACAAPPLVGWSRYIPEGMQCSCGIDYYTPHEETNN ESFVIYMFVVHFIIPLIVIFFCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEV TRMVIIMVIAFLICWLPYAGVAFYIFTHQGSDFGPIFMTIPAFFAKTSAV YNPVIYIMMNKQFRNCMVTTLCCGKNPLGDDEASTTVSKTETSQVAPA*

18 Maxim-Gilbert Sequencing
MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPWQFSMLAAYMFLLIML GFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADLFMVFGGFTTTLYTSLH GYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMSNFRFGE NHAIMGVAFTWVMALACAAPPLVGWSRYIPEGMQCSCGIDYYTPHEETNN ESFVIYMFVVHFIIPLIVIFFCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEV TRMVIIMVIAFLICWLPYAGVAFYIFTHQGSDFGPIFMTIPAFFAKTSAV YNPVIYIMMNKQFRNCMVTTLCCGKNPLGDDEASTTVSKTETSQVAPA*

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34 Logo for a) Splice acceptor b) Splice Donor c) Initiator Met

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