第五章 核素稀释法

核素稀释法 （Nuclide Dilution Technique） 系一种应用极为广泛的定量示踪法 在成分复杂的样品中测定某些成分，在混合物中分析性质类似、不易定量分离的元素以及测定整体内无法定量分离的某些成分的总量等。 放射性核素 稳定性核素

第一节 核素稀释法的基本原理 标记化合物--已知比活度为s1、质量为m1非标记物质量为m2的同一种化学形态的均匀混合时，标记分子被非标记分子所稀释， 混合物的放射性比活度s2必然比s1低。混合前后的总放射性应相等，即 s2（ml＋m2）＝ slm1 （5·1）

s2（ml＋m2）＝ slm1 如m2>>m1，上式可简化为s2m2=s1ml

放射性比活度 ： Bq或其派生单位/mol或其派生单位 m1和m2也应以mol或其派生单位 若稀释前后放射性探测效率相同，分子也可用cpm表示。若已知标记与非标记物分子量差别很小，或标记物在稀释前的放射性比活度不甚高，或某些生物大分子无法确知其分子量，则分母也可用g表示 m1和m2也应以mol或其派生单位 分析对象是液体，以及稀释前后物质在溶液中的浓度基本不变，也可用放射性浓度c（如dpm/ml）代替放射性比活度s，用稀释前后的体积υ代替质量m，写成如下关系： c2（υl十υ2）＝c1υ1  

第二节 基 本 方 法 一、核素正稀释法Direct Nuclide Dilution 第二节 基 本 方 法 一、核素正稀释法Direct Nuclide Dilution 已知量的标记物作为示踪剂来测定未知量非标记物的稀释法称为核素正稀释法 设:标记物的化学量为Y mmol， 非标记物的化学量为X mmol 放射性活度为D， 则稀释前记物的放射性比活度s1：

标记物和非标记物充分混匀后进行提纯，分离出任意量，测混合后样品的放射性比活度s2：   S1 S2 (5.2) 标记物的量Y和活度D为已知，再测得s2， 即可求得非标记物的量X。

举例： 欲测定蛋白质水解液中天冬氨酸的含量，将5mg放射性比活度为17kBq/mg的标记天冬氨酸加入水解液，充分混匀后分离出一部分高度纯化的天冬氨酸0.21mg，测得放射性比活度为0.37kBq/mg，求水解液天冬氨酸的含量。 解：已知Y=5.0mg，s1=17kBq/mg，s2=0.37kBq/mg，代入公式则

二、核素反稀释法 核素反稀释法（Inverse Nuclide Dilution） 用已知量的非标记物测定样品中标记物含量的稀释法称核素反稀释法 设标记物的化学量为g （未知） 已知或测得其放射性比活度为（s1=D/g） 因不能定量分离，加入同一化学形态的非标记物，已知其化学量为r 混合后分离部分样品纯化，测得放射性比活度为s2

s2（m1＋m2）=slm1 (5.3) 当r》g时，S2与S1相比极小，S1-S2=S1

若已知所加非标记物的量r，则分别测量两个放射性比活度s1和s2，即可求得标记物的量g。有时，样品中只有一种标记化合物，则可简化实验步骤，不测s1，而改为测样品的总放射性D。因为D＝gs1，上式可改成

举例： 解：设g为标记谷氨酸量，r＝13.1 mg，s1=356 cpm／mg, s2＝220 cpm／mg， 用14CO2通过植物光合作用生成放射性蛋白质，取少量蛋白质水解分出谷氨酸测得放射性比活度为356 cpm／mg，欲求谷氨酸含量，取166 mg mg蛋白样品，水解后加入非标记谷氨酸13.1 mg，混合后分出部分谷氨酸，测得放射性比活度为220 cpm／mg。 解：设g为标记谷氨酸量，r＝13.1 mg，s1=356 cpm／mg, s2＝220 cpm／mg， 蛋白质标记谷氨酸的质量百分比为

三、特殊核素稀释法 1．核素双稀释法（Double Nuclide Dilution） 核素双稀释法主要用于反稀释法。当样品中未知量为g的标记物；其放射性比活度Sg不易直接测量时，可采用双稀释法。 2．亚化学计量核素稀释法 （Substoichiometric Nuclide Dilution Analysis） 亚化学计量核素稀释法是将亚化学计量分离原理用于核素稀释法的一种分析技术。

第三节 必要的条件 必要的条件是制备和待测物质化学上完全相同的标记物和建立分离、纯化样品的可靠方法。 1.正确选用标记物: 第三节 必要的条件 必要的条件是制备和待测物质化学上完全相同的标记物和建立分离、纯化样品的可靠方法。 1.正确选用标记物: 标记物在化学性质上要和待测物完全相同；标记原子要在化合物的稳定位置；标记的纯度要高；用于整体成分测定时还要求标记原子在体内也不发生非代谢性交换；生物行为与非标记物完全一致；标记物必须无毒性。

2.准确的稀释度 为使分离出的样品具有准确稀释度，必须确保标记原子和非标记原子混合均匀。进行体内稀释实验时，完全混匀的时间一般通过实验确定。

3.建立分离、纯化样品的可靠方法 分离、纯化混匀后的样品是核素稀释法的关键步骤之一。可采用沉淀、溶剂提取、离子交换、纸层析等方法。

第四节 优点与限制 核素稀释法的最大优点 是不要求待测物质定量回收。特别在下列情况应用更具优越性： （1）未知物质不可能定量分离； 第四节 优点与限制 核素稀释法的最大优点 是不要求待测物质定量回收。特别在下列情况应用更具优越性： （1）未知物质不可能定量分离； （2）需要快速分析； （3）需分离的物质浓度很低，用一般常规方法无法避免物质在容器上的吸附； （4）测量整体分布容积，如人体水份的测定。

核素稀释法的局限性， 有时不易获得和待测物质化学上完全相同的标记物，这就影响分析工作的正常进行； 用放射性核素稀释法，由于要测放射性活度，必须分离出足够的样品量； 用放射性核素正稀释法作物质定量时，欲使误差＜±3％，待测物与标记物含量之比不得超过2:1否则误差将增大。

第五节 稳定性核素稀释法 稳定性核素的探测技术有较大的突破，气相色谱和质谱的联合应用，把样品的分析纯化、结构定性和核素含量比的测定三者结合起来，不仅提高了准确性、特异性和灵敏度，而且简化了操作步骤。此外，它无辐射损伤、不污染环境，适应范围更为广泛 .

第六节 核素稀释法的应用 一、测定体液体积和成分 第六节 核素稀释法的应用 一、测定体液体积和成分 核素稀释法已成为测定体液体积最为广泛应用的方法。活体上体液的测定主要是整体水份及其两个主要部分，即细胞外液和细胞内液的测定。核素稀释法实际是测定示踪剂的分布空间，从而得出体液的近似体积。

细胞外液的测量 是利用Cl或Br主要在细胞外液均匀分布、进入细胞内极少的特性。测得的细胞外液即是Cl或Br在体内的分布空间，测量的不同值取决于各种示踪剂的分布空间。

Br有部分进入红细胞，需予以校正

测量各种体液常用的示踪剂 示 踪 剂 整体水份 D2O,3H2O,125I-4-磺化安替比林, N-乙酰基-4-氨基安替比林 细胞外液 放射性钠， 溴, 蔗糖, 169Yb-DTPA

表5·2 身体组成的正常值

二、生化成分的分析和药物的定量 14C—氨基酸在tRNA和ATP存在下，通过氨基酰tRNA合成酶的作用形成14C-氨基酰-tRNA。若反应液中同时存在待测氨基酸，则形成非标记的氨基酰-tRNA，因而参入到氨基酰-tRNA的14C就被稀释。待测氨基酸的量越多，稀释程度也越大。求得这种稀释比例和氨基酸量间的关系，就可进行氨基酸的定量

样品中的氨基酸量（mol） 图5-l 氨基酸标准曲线

图5-3 稳定核素稀释法测定血浆中雌二醇含量

应用核素稀释原理还可分析前身物和产物的关系。设某化合物的代谢顺序是： A→B→C 若A是标记前身，它能参入B和C。当标记前身A的量不变，加入非标记的A时，标记前身A的标记原子被稀释，B和C的放射性比活度也相应降低。如加入非标记B而使参入产物C的标记原子减少，放射性比活度下降，表明B可能具A→C的中间代谢产物。如曾认为一种化合物AIC（4-氨基-5-咪唑甲酰胺）是由甘氨酸转变为次黄嘌呤的中间产物。实验采用14C-甘氨酸作为前身物，加入非放射性AIC为载体，发现次黄嘌呤的放射性比活度并没有因为加入上述载体而降低，从而否定了AIC是中间代谢产物的看法。

三、测定标记物的纯度及稳定性 核素反稀释法是标记物纯度鉴定的有用方法之一。核素反稀释法还可用来测定复杂介质中标记物的稳定性。 将两种物质的标记物和人胃液在37℃保温。 t＝0，放射性活度=A0 放射性比活度=S0 其量为X0  

温育4～5h后，加入大量非标记物，其量为Y，时间为t时，标记物量为X; 用适当方法将混合物分离出一部分，测出放射性比活度为St，当载体量很大时，即Y＞＞X0 或S0／St＞＞l，则XS0＝YtSt，即在t时，标记物存留量为

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