第二章 克隆技术 第三节 动物的克隆

动物细胞培养和组织培养 动物组织培养技术的发展 动物组织培养的基本方法和过程 动物克隆培养法（细胞克隆） 动物的克隆繁殖 动物克隆的基础是动物细胞培养和组织培养 细胞培养是研究细胞结构和生理的主要手段 动物细胞培养和组织培养 动物组织培养技术的发展 动物组织培养的基本方法和过程 动物克隆培养法（细胞克隆） 动物的克隆繁殖 动物细胞融合和单克隆抗体的制备 课堂练习

动物细胞培养和组织培养 动物细胞培养 动物组织培养 动物细胞培养和组织培养的关系 将动物体内部分组织取出，分散成单个细胞后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖 机械方法或胰酶消化 体外控制条件 细胞培养 切取动物组织块 组织细胞分散为单细胞 细胞保持生长、分裂、接触抑制和有规律的衰老、死亡等生命活动现象 动物组织培养 动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性 动物细胞培养和组织培养的关系

动物细胞培养和组织培养的关系 统称为组织培养 细胞培养中，培养液中各细胞彼此相互依存，细胞培养的后代在某种程度上会表现出一定的组织特性 组织培养中，长期的组织培养往往只能使单一类型的细胞保存下来，而成为简单的细胞培养 细胞培养 统称为组织培养 各种生物体结构成分的体外培养 组织培养 器官培养 动物细胞培养不能像植物组织培养那样最终培养成新个体

动物组织培养技术的发展 1885年 鸡神经板“生理盐水”培养存活 1903~1907年 用血清、腹水和淋巴液作为培养基（含各种营养成分、生长因子并维持渗透压），使细胞在体外长期存活并生长——悬浮培养法 用鸡胚浸出液作为添加剂，进行原代培养和长期的传代培养 1912年 细胞培养瓶（卡氏瓶）发明 1950年 人工培养液“199”研制成功 1943~1951年之后 能无限传代的细胞系和细胞株培养成功 L—细胞系 HeLa细胞系

贴壁生长和接触抑制 贴壁生长 接触抑制 在细胞体外培养中，动物细胞会粘附于介质上，成单细胞层紧贴生长 在离体条件下，正常的动物细胞分裂生长到表面相互接触时，就会停止分裂增殖的现象 与细胞表面的糖蛋白有关

原代培养、传代培养、细胞系和细胞株 原代培养 不能继续增殖 传代培养 细胞系 连续细胞系特点： 细胞株 特点： 将组织细胞分离后，置于第一个培养瓶中培养的过程（有时也指细胞分裂10次内的培养） 营养消耗，接触抑制 不能继续增殖 传代培养 将培养的细胞分离后，分装到多个培养瓶中培养继续培养的过程 有限细胞系 传代次数有限 细胞系 传代培养后可连续传代的细胞 连续细胞系（无限细胞系） 连续细胞系特点： 细胞发生了转化 （遗传物质改变），多数具有异倍体核型 有的只具有不死性，但仍保留接触抑制和无异体致癌性；有的不仅有不死性，还具有异体致瘤性 有限细胞株 细胞株 通过一定的选择和纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞 连续细胞株 特点： 细胞具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等

贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，制成细胞悬液 动物组织培养的基本方法和过程 动物组织培养的一般流程 分解细胞外的胶原纤维和其他成分 幼龄动物：生命力旺盛，分裂能力强 剪碎组织 胰蛋白酶处理分散成单个细胞 震动 取动物组织块 转入培养液中进行原代培养 加培养液制成细胞悬浮液 细胞分散、充分接触营养液 贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，制成细胞悬液 放入CO2培养箱中保温培养 分装到多个培养瓶中进行传代培养

细胞克隆（动物克隆培养法） 克隆培养法（细胞克隆）——获得细胞株的方法 结果 最基本要求 提高细胞克隆形成率的措施 用途 把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术 结果 获得纯系细胞（遗传单一，表现相似） 最基本要求 保证所建成的克隆来源于单个细胞 提高细胞克隆形成率的措施 只有对培养环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞，才容易做细胞克隆。如：无限细胞系 选择适宜的培养基 添加血清 以滋养细胞支持生长 激素刺激 使用CO2培养箱调节PH 用途 从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系，来研究某些蛋白质的功能

动物的克隆繁殖 动物细胞全能性的表现程度 动物难以克隆的根本原因 细胞核移植实验和动物的克隆繁殖 细胞核移植实验 “多莉”的克隆过程 “多莉”克隆成功的原因和理论意义 动物克隆的意义

动物细胞全能性的表现程度 同一动物不同时期和不同部位的细胞，全能性表达程度不同 全能细胞 具有全能性，具有使后代细胞形成完整个体的潜能。如：受精卵及早期胚胎细胞 多能细胞 只具有分化出多种组织细胞的潜能。如：多能造血干细胞 专能细胞 只能分化为一种细胞。如：单能造血干细胞和表皮生发层细胞 特化细胞 不再分化为其他细胞。如成熟的红细胞 注意： 1、低等动物细胞的全能性一般比较容易体现 2、特化细胞的细胞核中仍然具有完整的基因组，仍具有全能性

动物难以克隆的根本原因 细胞高度分化导致基因组中基因的活动很不完全 使关闭基因恢复表达能力的思路 有些基因开放或活动加强 个体发育的细胞 基因调控合成专一性调控蛋白质 有些基因开放或活动加强 个体发育的细胞 基因选择性表达 部分基因关闭 使关闭基因恢复表达能力的思路 给予或消除细胞能调控基因表达的物质并具有适宜营养条件 卵细胞中可能具备让所有基因恢复表达的条件

细胞核移植实验 方法 类型（以哺乳动物的克隆为例） 利用一个细胞的细胞核（供体核）来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞）的过程 方法 显微注射和高效细胞融合方法 将体细胞核或胚胎细胞核移植大去核卵细胞中，是使这些细胞核恢复全能性表达的基本途径 用核移植的方法得到的动物称为克隆动物 类型（以哺乳动物的克隆为例） 胚胎克隆 胚胎细胞核移植（易成功） 1981年，克隆鼠 体细胞核移植（难度高） 体细胞胎克隆 1997年，克隆羊“多莉”

“多莉”的克隆过程 过程 1997年 苏格兰罗斯林研究所 维尔穆特 去除细胞核（N） 取卵细胞 去核卵细胞 胚胎移植 分裂至8细胞胚体 1997年 苏格兰罗斯林研究所 维尔穆特 过程 去除细胞核（N） 取卵细胞 去核卵细胞 苏格兰黑面母羊 另一苏格兰黑面母羊 胚胎移植 分裂至8细胞胚体 体外胚胎培养 核移植入去核卵细胞 妊娠、分娩 白色芬兰母羊 “多莉” 核DNA与白色芬兰母羊相同 取出细胞核（2N） 取乳腺细胞 营养限制性培养

“多莉”克隆成功的原因和意义 成功的原因（哺乳动物体细胞克隆最复杂） 理论意义 重组卵细胞最初分裂时仅复制DNA，而不进行基因转录，导致原有的基因抑制的调节蛋白不能继续合成 核中原有调节蛋白不断分解（营养限制性培养）并被卵细胞质中蛋白质替换，至第3次卵裂时基本替换完成 卵细胞中的蛋白质将DNA表达过程重新编排，胚细胞开始表达自己的基因 理论意义 高度分化的细胞经过一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能（分化了的动物细胞核具有全能性） 细胞质具有调控细胞核发育的作用（卵细胞的细胞质可以为核的全能性表达提供条件）

动物克隆的意义 为遗传疾病的治疗提供新途径 能够快速、高效繁殖动物 有利于濒危动物的保存和基因保护 有利于对转基因动物的扩增和繁殖

动物细胞融合和单克隆抗体的制备 动物细胞融合技术和原理 单克隆抗体的制备原理和过程 单克隆抗体概念和制备思路 单克隆抗体的制备过程 单克隆抗体应用 杂交瘤技术制备单抗的优点 可以从特异抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗 单抗的应用 作为特异探针（单抗诊断盒），研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能 练习

动物细胞融合技术和原理 概念 原理 诱导融合的方法： 融合的特点 应用 两个或多个动物细胞融合成一个细胞的现象。 细胞膜的流动性 动物细胞融合和杂交一般不能培养成杂交个体 灭活的仙台病毒、聚乙二醇、电刺激 融合的特点 可以发生在基因型相同或不同的细胞之间 发生在基因型不同的细胞之间的融合叫细胞杂交 应用 因为细胞杂交中染色体容易丢失 进行基因定位；通过杂交瘤技术制备单克隆抗体

灭活仙台病毒诱导体细胞融合 病毒颗粒 灭活病毒黏附于 细胞表面 细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜 连接 形成 杂种细胞

单克隆抗体和制备原理 概念 用单个杂交瘤细胞经过无性繁殖（克隆）形成细胞群，这样的细胞群就能产生出化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体称为单克隆抗体 抗体由效应B淋巴细胞合成，但体内效应B淋巴细胞种类多，合成的抗体为混合抗体 效应B淋巴细胞不能连续增殖，无法长期体外培养并不断获得抗体 原理 杂交瘤技术 骨髓瘤细胞在体外培养条件下能无限增殖，而B淋巴细胞能产生抗体。由这两种细胞融合得到的杂交瘤细胞具有双亲的遗传物质，因此它既能无限增殖，又能产生特定抗体，从而可以获得大量单克隆抗体

单克隆抗体的制备过程 正常小鼠的免疫处理 动物细胞融合 给小鼠注射特定抗原 提取 浆细胞 产生特定抗体的杂交瘤细胞 融合筛选 杂交瘤细胞 培养筛选 骨髓瘤细胞 扩大 培养 体外培养 体内培养 从营养液中提取 从小鼠腹水中提取 单抗 杂交瘤细胞的筛选与培养 单抗的提取

杂交瘤细胞的筛选 第一次筛选：选出杂交瘤细胞（多种） （B、 B—B、 B—瘤、 瘤—瘤、 瘤） 第二次筛选：选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞

课堂练习 动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于 A.培养基不同 B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行 C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能 D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株 【答案：A】 2.一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能 A.有选择地繁殖某一性别的家畜 B.用于保存物种 C.繁殖家畜中的优秀个体 D.改变动物的基因型 【答案：D】

3. 如果用动物的细胞进行克隆实验应该选择的细胞核不能是 A.乳腺细胞的 B.卵细胞的 C.胃腺细胞的 D.囊胚时期的胚胎细胞的 【答案：B】 4. 美国杜克大学医疗中心的一个研究小组利用成年猪的动脉血管细胞和模拟胚胎环境的新型生物反应器，成功地在实验室里培育出新的动脉血管。这种血管的外形和功能都与真的血管一样，这一研究成果是生物组织培养领域的重大进展。下列关于以上技术的叙述中,不正确的是 A．属于“克隆” B．可能要利用去核卵细胞 C．关键是激发血管细胞的全能性 D．关键是激发血管细胞发育成血管的潜能 【答案：C】

5. 1952-1953年，美国科学家斯提瓦用胡萝卜根的悬浮培养细胞进行人工培养，发现单个细胞能像受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植株。1997年英国维尔穆特等人从白面母绵羊体内取出乳腺上皮细胞静息培养，然后把它的核移入黑面母绵羊去核的卵细胞中形成重组细胞，并将重组细胞培养成胚胎，将胚胎植入另一母羊的子宫内后获得了克隆羊多利。 阅读这段材料后，回答下列问题： （1）文中的悬浮培养细胞和乳腺上皮细胞均为__________。 （2）斯提瓦的实验证明了_________________维尔穆特的实验证明了___________________。从细胞结构和遗传角度分析，两位科学家实验结论的得出，根本原因在于：_______________________________________________ （3）斯提瓦和维尔穆特实验的差别在于： 体细胞 植物细胞具有全能性 动物细胞核具有全能性 细胞核中具有个体发育的全套基因 植物体细胞直接就可发育成植株，而动物细胞核全能性的证实需借助于卵细胞。

单抗练习 1.科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是 1.科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是　 A.经过免疫的B淋巴细胞 B.没经过免疫的B淋巴细胞 C.经过免疫的T淋巴细胞 D.没经过免疫的T淋巴细胞 【答案：A】 2.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定的培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不能生存、增殖的是 ① B淋巴细胞 ② 小鼠骨髓瘤细胞 ③ B淋巴细胞自身融合细胞 ④ 小鼠骨瘤细胞自身融合细胞 ⑤ 杂交瘤细胞 A．①③ B．②④ C．①③⑤ D．①②③④ 【答案：D】

3.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案 B 体外培养 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 足够数量的细胞群 注射到 小鼠腹腔 A C 1）该实验方案的 目的是__________ 制备单克隆抗体 2）A是从小鼠的脾脏中取得_______ , 该细胞能够产生______。 浆细胞 抗体 细胞融合 3）图中B为 ________ 过程，常用 ____________作为诱导剂，该细胞 继承___________的遗传特性，既 能__________,又能___________。 灭活的病毒 双亲细胞 分泌抗体 无限增殖 4）C过程指细胞培养，该过程包括 _____培养和_____培养两个阶段 原代 传代 5）该方案能达到预期效果吗？为什么？ 不能。因为小鼠没有注射特定抗原，所以无法获得能产生抗破伤风抗体的浆细胞。