生物制品质量检验 葛俊伟 兽医微生物与免疫学教研室

生产管理与质量检验标准概述 1 生物制品的质量检验 2 抽样 无菌检验或纯粹检验 安全检验 效力检验 其他检验

一、药品生产管理与质量检验标准 自1969年世界卫生组织(WHO)宣布《药品生产管理规范(Good Manufacturing Practice，GMP)》以来，美国、日本、德国、瑞士等一百多个国家相继颁布了本国的GMP，我国也在1988年公布了《药品生产管理规范》。目前，GMP已成为国际公认并遵守的药品生产管理与质量检验的基本准则。 GMP涉及的内容十分广泛，一方面要求每个药品生产厂家具有合格的硬件条件，即厂房、仓库、空气清洁装置、污水处理和绿地等；另一方面还必须具有一系列能保证产品质量的软件条件，即人员素质、管理和技术等。 GMP的主要内容包括如下几个方面：

1. 厂房和厂区 厂址选择城镇郊外，环境幽静、空气清洁的地区。厂区绿地与建筑物地面比为10:1.5 — 10:2.0。长内水泥路面，无露土地面。厂区与生活区分离，健康动物区与污染区分离，洁净区、控制区和污染区不得直接接触。水质符合卫生标准。 长内照明充足，具有必要的通风、空调、净化等设备，生产工序衔接合理，人和物分流，并按生产工艺划分清洁区和清洁等级。 2. 设备 所有设备应符合轻质、体积小、有惰性、耐磨损、防腐蚀和低噪音、易清洁和消毒等要求。全部设备应依工艺要求尽可能为联动操作或自动控制。

3. 工艺 工艺流程布局要科学、合理，工艺流程中的各种条件应予以保证。 4. 实验动物 生物制品生产和检验用动物均应符合等级动物标准，至少要达到清洁级实验动物标准。生产和检验禽类生物制品的禽和卵应为SPF标准。动物房的环境控制应符合等级动物标准。 5. 人员素质 专业技术人员要按GMP标准进行专业训练，才能按GMP标准生产出符合GMP的优质产品。

二、生物制品的质量检验 生物制品的质量检验，应从用于生产的菌种、毒种、虫种和原材料到半成品的检查，直至最终的成品检验，都属于质量检查范围，应贯穿于生产的始终，即全面质量管理(TQC)。 生物制品质量检验主要包括物理性状检验、无菌或纯粹检验、枝原体检验、鉴别检验、活菌计数或病毒含量测定、安全检验及外源病原体检验、效力检验(效价或恃异检验)、剩余水分检验、真空度测定，以及灭活剂、防腐剂的检查等。 上述各项检验项目，主要是指成品检验，但有的只用于某些制品，如剩余水分检验和真空度测定，只用于冻干制品；活菌计数和病毒含量只用于弱毒活疫苗等。

抽样 应随机取样，样品应有确切的代表性。 不同生物制品都有相应的规定。 抽取样品数依需要而定。

（一）无菌检验或纯粹检验 生物制品(除另有规定者外)都不应有外源微生物污染。灭活疫苗不得含有活的本菌或本毒。因此各类生物制品必须按规定进行无菌检验或纯粹检验，全部操作应在无菌条件下进行。 1.检验用培养基 厌氧及需氧性细菌检验用硫乙醇酸盐培养基(T.G)及酪蛋白胨琼脂(G.A)，霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨培养基(G.P)。 注：上述培养基均须用指定的需氧菌菌株、厌氧菌菌株及霉菌菌株做灵敏度测定，达到标准后方能使用。

2. 检验方法及结果判定 (1) 含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品 用T.C培养基50m1，接种供试品(冻于制品先做10倍稀释)1m1，置361C培养，3天后自小瓶中吸取培养物，分别接种T.C小管和 G.A斜面各2支，每支0．2m1，1支置361C，1支置251C；另取0．2m1接种1支G.P小管，置251C，均培养5天，应无菌生长。 (2) 细菌性活疫苗及不含防腐剂、抗生素的其它制品 将供试品(冻干制品加稀释液恢复原量)接种T.G小管、G.A斜面或适于本菌生长的培养基各2支，每支0.2m1，1支置361C，1支置251C。另用1支G.P小管，接种0．2m1，置25-361C，均培养6天。细菌性活疫苗应纯粹。

(3) 血液制品和混浊制品 如未加防腐剂或抗生素，可直接用不加琼脂的T.G小管和G.A斜面，接种量、培养条件、时间和判定标准同2项，如加有防腐剂或抗生素，检验方法和判定同1项。如培养后混浊不易判定时，可移植培养后再判定。 (4)判定结果 每批抽检的样品(除允许含一定数量非病原者外)应全部无菌或纯粹生长。如发现个别瓶有杂菌或结果可疑时，可重检原瓶(如为安瓶或冻干制品，可重抽样品)，如无菌或无杂菌生长，可作无菌或纯粹通过。如仍有杂菌，可抽取加倍数量的样品重检，个别瓶仍有杂菌，则作为污染杂菌处理。

（二）安全检验 生物制品的安全性是其首要的条件，各种制品都必须经过安全检验合格者方可出厂。 1．安全检验的内容 2．安全检验的方法及要点 3．安全检验结果的判断 检验外源性污染 检查杀菌、灭菌或脱毒情况 检查残余毒力或毒性物质 检查对胚胎的毒性

可能来源---如活疫苗在采用细胞培养时： 1安全检验的内容 检验外源性污染 包括上述无菌与纯粹试验在内，不仅是因为有致病性细菌的污染，而且即使是非病原菌，如数量过多，其代谢产物也会影响安全。另外，外源性的病毒及支原体的污染亦是影响安全的重要方面。 可能来源---如活疫苗在采用细胞培养时： ①可通过培养病毒的组织细胞带来外来的病毒，如猪瘟兔化弱毒疫苗采用猪肾细胞培养时，有可能带入野外猪瘟强毒； ②细胞培养多用犊牛血清，犊牛血清就可能带入牛腹泻病毒； ③使用鸡胚则可能带入鸡白血病等病毒。 ④除原材料以外，生产环境不佳及操作不严密，亦可能造成外源性污染。 生产全过程各个环节，均须重视防止污染。

检查杀菌、灭菌或脱毒情况 检查残余毒力或毒性物质 灭活疫苗都是以致病微生物加入甲醛或其它灭活剂灭活，而类毒素则是加入甲醛将毒素脱毒。 但如灭活不彻底或脱毒不完全，都影响制品的安全性。 检查残余毒力或毒性物质 检查残余毒力 这主要是对活疫苗而言。所谓残余毒力是指生产这类制品的菌(毒)种，本身是活的减毒株或弱毒株，允许有轻微毒力的存在，能在接种的机体内表现出来。 如无毒炭疽芽孢苗菌种的毒力标准是允许实验动物(小鼠、家兔、豚鼠)在注射部位引起剧烈水肿，但家兔不能死亡，豚鼠可死亡1/2，而小鼠可全部死亡。 又如羊痘鸡胚化弱毒疫苗，安全试验的标准是试验羊2/3可发生不全经过型痘种，接种局部皮肤的表面应出现0.5-4cm微红色或无色的丘疹(痘肿)，持续10天左右，有的还有体温反应，但不应有其它异常现象。

有的病毒致弱毒株虽对免疫动物已经致弱，但还能通过孕畜影响胚胎。 检查残余毒力或毒性物质 检查残余毒力 毒性检查主要是对死菌苗或类毒素这类制品，这类制品虽经杀菌或脱毒，仅具有抗原性，但其本身的某些成分，当接种一定量时，可引起对机体的有害反应，即毒性反应。 在冻干活菌疫苗中有的也出现毒性反应，如副伤寒活疫苗，冻于后的存活率过低会出现内毒素反应，有时引起死亡，在这种情况下采用口服免疫可以避免。 检查对胚胎的毒性 有的病毒致弱毒株虽对免疫动物已经致弱，但还能通过孕畜影响胚胎。 如国外猪瘟的某些弱毒株，就可通过孕猪的胎盘屏障传给胚胎以致造成死胎、胎儿畸形或生后发育不良等。因此欧洲药典中明确规定猪瘟病毒应经过对胚胎毒性的检查。 其检查方法是：选10头未免疫的母猪在怀孕25-35天时肌肉注射两头份的疫苗，同时另选10头未免疫的同龄同源怀孕母猪注射等量生理盐水，然后观察疫苗对胎儿或仔猪是否有影响。

2．安全检验的方法及要点 成品的安检方法主要是动物检验。 安检剂量应大于使用剂量。能以小动物作出正确判断者，则多用实验小动物，这主要是材料易得，费用较低。 禽苗则可直接以使用对象动物作安检。 但无论使用何种动物，其首要条件是选用敏感的动物。

影响安检结果的因素 安检动物要求一定的品种，譬如猪丹毒以鸽和小鼠比较敏感；而猪肺疫则以家兔比较敏感。 但同一种动物不同品系其敏感性也下一样，如鸡新城疫的安检鸡，用我国土种鸡就不如用来航鸡敏感。 又如不同日龄的小鼠对猪丹毒的敏感性也下一致，日龄过大则敏感性差。到底哪种日龄动物最适宜，各种动物不一样。 一般概念敏感动物是不含母源抗体的，如以猪检查猪瘟疫苗的安全性，就必须检查供试猪是否含有母源猪瘟抗体，无母源抗体者方可使用。 动物的健康状况也与安检结果的正确判断密切相关。 试验期间的饲养管理也会影响安检结果的判断，安检动物舍应与健康动物和其它试验动物分开，以免相互干扰，即必须在专用动物舍内进行。

3．安全检验的判断 (1)安检期死亡动物经解剖明确非制品所致者可以重检，如检验结果可疑难以判定时，应以加倍头数该种动物重检。 (2)凡规定用多种动物进行安检的制品，如牛瘟兔化绵羊化活疫苗用小鼠和豚鼠两种动物检验，两种均应安全合格。 (3)用小动物检验不合格者，有的规定可用使用对象动物重检。但用使用对象动物检验不合格者，不能再以小动物重检。

（二）效力检验 1．效力检验的内容 2．成品的效力检验 3．影响效检的因素与应注意的问题 制品的效力是指它的使用价值。效力不好的制品，如为疫苗和类毒素，则无法有效地控制疫情；如为治疗用的血清，则无法医治病畜，从而使疫病蔓延；如为诊断制品，则影响检疫及诊断的正确性。 1．效力检验的内容 2．成品的效力检验 3．影响效检的因素与应注意的问题 免疫原性 制品的免疫持续期 抗原的热稳定性 抗原量的测定检查

1效力检验的内容 免疫原性 首先是菌(毒)种的免疫原性应良好，制备生物制品的菌(毒)种的免疫原性，应经过周密的试验测定。 如制猪丹毒灭活疫苗的菌种应选择2型菌，因为2型菌株免疫原性良好，试验证明对其它菌型也有免疫力。 又如流感与口蹄疫，因其在流行中病原常有型的变化，所以用以制备疫苗毒株的型必须与流行型相对应。否则即使是制品的免疫原性良好，也收不到免疫效果。

效力检验的内容-续 制品的免疫持续期 抗原的热稳定性 抗原量的测定 理想的制品应具有较长的免疫持续期，免疫持续过短的应考虑增加免疫接种的次数。 抗原的热稳定性 一般灭活苗和血清的热稳定性较好，弱毒疫苗较差。热稳定性也与制品中所加入的冻干稳定剂的种类或制备工艺有关。 抗原量的测定 活的疫苗的效力取决于接种动物的毒量，即一定量病毒(细菌)才能在体内增殖到一定程度，促使机体产生免疫应答，若数量不够，则达不到免疫效果。过多还会出现副作用，所以常以测定抗原量来检查制品的效力。 制品中的抗原量并非愈多愈好，应求其适当有效量，规定上限和下限

2 成品的效力检验 动物保护力试验：是兽用生物制品最常用的检验方法。 活菌计数与病毒量的滴定 血清学试验 定量强毒攻击法 变量免疫定量攻击法 2 成品的效力检验 动物保护力试验：是兽用生物制品最常用的检验方法。 定量强毒攻击法 变量免疫定量攻击法 被动免疫抗体测定 活菌计数与病毒量的滴定 血清学试验

用经高度免疫的动物抗病血清注射易感动物，经一定时间(一般1-3天)用相应的强毒攻击，观察血清抗体被动免疫所引起的保护作用。 动物保护力试验 定量强毒攻击法 这种方法是以待检品接种动物，经2-3周后，用相应的强毒攻击。观察动物接种后所建立的自动免疫抗感染水平，即以动物的存活或不受感染的情况来判定制品的效力。 变量免疫定量攻击法 即将疫苗稀释为各种不同的免疫剂量并以之接种动物，间隔一定时间待动物的免疫力建立以后，各免疫组均用同一剂量的强毒攻击，观察一定时间，用统计学方法计算能使50%的动物得到保护的免疫剂量。 被动免疫抗体测定 用经高度免疫的动物抗病血清注射易感动物，经一定时间(一般1-3天)用相应的强毒攻击，观察血清抗体被动免疫所引起的保护作用。 各种抗病血清的检验均用此法。 有的疫苗也可用这种方法检定效力，即用疫苗接种免疫试验动物后，然后采取免疫动物的血清测定其抗体效价，来判定疫苗的免疫力，如羊梭菌多联干粉灭活疫苗即用此法。

活菌计数与病毒量的滴定 A. 活菌计数 某些活疫苗的菌数与保护力之间有着密切而稳定的关系，因此，可以不用动物来测保护力，只需要进行细菌计数。活菌数能达到使用剂量规定要求者，即可保证免疫效力。 如无毒炭疽芽孢苗计活芽孢数，每毫升含活芽孢数应在：500万-2000万之间。布鲁氏菌活疫苗、仔猪副伤寒活疫苗也是用计活菌数测定。 B. 蚀斑计数或其它滴定病毒量的方法 鸡马立克氏病活疫苗采用蚀斑计数，蚀斑的数量又与鸡保护率之间有直接而稳定的关系。 鸡新城疫低毒力活疫苗测其EID50，每头份EID50≥106为合格。如用细胞培养则用TCID50来计算其病毒滴度。

血清学试验 成品检验中使用血请学检验方法者，主要用于诊断用制品，因为绝大多数诊断制品都是用于血清学试验，所以也必须用血清学方法检验其敏感性和特异性， 在其它生物制品中也有少数使用血清学方法检验的， 如牛瘟活疫苗，在效检时当体温反应可疑时可用体温可疑牛的血清以免作中和试验以判定其效力。 又如马传染性贫血病活疫苗的效检，是以安全检验马定期作血清学检查，凡血清学阳转2/3-3/4者，认为其效价合格。

影响效检的因素与应注意的问题 (1) 检验动物的影响 效力检验目前主要还是以动物保护法为主，动物的品种、健康状态和饲养管理等对效力都有明显的影响。 (2)培养基的影响 使用的培养基，特别是作活菌计数的培养基对计数结果影响更为明显。 (3) 增设标准品对照 使用标准品或参照品作为对照，这对正确评价制品效力会有影响。

（四）其他检验 物理性状检验 (1)液体疫苗和诊断液 各种液体疫苗及诊断液，标签等外观必须符合其规定要求，如炭疽芽孢苗静置后为透明液体，瓶底应有少量白色沉淀；又如含氢氧化铝胶的灭活菌苗，静置时上部应为黄棕、黄褐或褐色透明液体，下部为氢氧化铝胶沉淀，振摇后为均匀混浊液，但所有这类制品应无异物，无摇下散凝块及霉团等，同时检查瓶装量是否准确，封口是否严密，瓶签有无差错等。 (2) 血清制品 所有血清都应为微带乳光橙黄色或茶色清朗液体，不应有摇不散的絮状沉淀与异物。若有沉淀时，稍力摇动，即成轻度均匀混浊。装量、封口、瓶签同时检查。 (3) 冻干疫苗 应为海绵状疏松物，色微白、微黄或微红，无异物和干缩现象。如为安瓶应无裂口及烧焦物。冻干制品加稀释液或水（原量）稀释振荡后，应在常温5min内迅速溶解成均匀一致悬浮液。

干燥制品剩余水分检验 冻干制品都要求测定水分含量，水分含量高低，直接影响制品的质量和保存。冻干制品剩余水分均不应超过4%。测剩余水分的方法有两种。 (1)真空烘干法 取样品置于含有五氧化二磷的真空烘箱内，抽真空度达133.322～666.61Pa，加热至60-70C干燥3小时，两次烘干达到恒重（恒重指物品连续两次干燥后重量差异在0.5mg以下的重量）为止，减失的重量即为含水量。水分计算公式为： 含水分％（样品干前重 - 千后重）/干前重X l00

(2) 卡氏测定法 卡氏测定法是利用化学方法来测定制品的含水量。卡氏试剂用的化学药品为碘、二氧化硫、甲醇、吡啶。其原理为：因水分能与碘、二氧化硫发生作用，因一分子水与一分子碘作用后，大量碘能与微量水起反应，碘即变为碘化物，溶液由原来的棕红色，吸水后变为无色，可用肉眼来观察终点，计算制品的含水量。 无论哪种方法测水分都应注意不受或少受空气湿度的影响，因为冻干制品都容易吸潮，所以在操作中，一是要掌握快速、二是要在干燥环境中进行、三是所使用的工具都必须干燥。在上述两种方法中卡氏法要求更高，雨天不宜进行，且化学药剂的配制标化保存都比较麻烦，所以一般部使用真空法。

真空度测定 经冷库保存的冻干制品，出厂前两个月应由监察室测定真空度，无真空的制后，应子剔除报废，不得重抽真空。真空测定的方法是通过高频火花真空测定器来测定，凡容器内出现白色、粉色或紫色辉光者为合格。 有些生物制品还需要以下检验：苯酚（石炭酸）含量测定、汞类防腐剂含量测定和甲醛含量测定。

谢谢各位！