大黄素对胰腺癌转移微环境的调控作用及机制 2015-02-06

胰腺癌：是一种预后很差的消化道恶性肿瘤，占全世界的恶性肿瘤死亡率的第四位，其病死率呈逐年上升趋势。手术切除是提高胰腺癌病人生存率的唯一希望，但是85%的病人在就诊时已属晚期，仅10~15%左右可以手术治疗，术后1年生存率25%，术后5年生存率平均不超过5%，且在过去30年中其生存率并无显著提高。除手术外，化疗也是目前治疗进展期胰腺癌、预防术后复发、延长病人生存时间和提高生活质量的重要手段之一。 胰腺癌的生物学特性：多中心起源，侵袭性强，早期易发生血管侵犯和远处转移。

肿瘤前转移微环境（pre-metastatic niche）学说：最新研究表明，在肿瘤转移到特定器官之前，肿瘤细胞和靶器官微环境之间就已经发生一系列相互作用； Kaplan等指出，肿瘤转移发生前，在靶器官观察到血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）的表达，VEGFR1阳性细胞表达纤维连接因子受体VLA4蛋白，在靶器官局部积累，形成一个对于肿瘤细胞非常有吸引力的“停泊位点”； Rafii等指出，原发灶肿瘤细胞分泌的细胞因子对前转移微环境有重要的调控作用，原发灶肿瘤细胞释放可溶性细胞因子，VEGFA，TGFβ，TNFα，和内皮性细胞营造一个适合肿瘤细胞年付和浸润的微环境。

TGFβ/Smads信号传导通路：TGFβ参与调节细胞生长、分化、凋亡、迁移、细胞外基质合成、沉淀反应等过程，TGFβ通过细胞侵袭、上皮细胞-间叶细胞转变（EMT）、抑制机体抗肿瘤免疫反应进一步促进肿瘤浸润和转移；Smads蛋白家族是TGFβ信号途径中的关键分子，直接参与TGFβ超家族的信号转导，具有核转位功能和转录活性； Padua等指出，TGFβ通过Smads信号通路激活循环中肿瘤细胞血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）的表达，从而增强细胞滞留能力，肿瘤细胞分泌ANGPTL4会破坏内皮细胞的连接，增加毛细血管的通透性。 循环中的肿瘤细胞渗出血管壁是其转移的限速步骤，血管生成素（Angpt）基质金属蛋白酶（MMPs）在肿瘤微环境、恶性肿瘤和血管重塑中起着重要的作用； Gupta等指出，转移的肿瘤细胞分泌某些因子如Angpt4和MMP1，会破坏血管内皮的紧密连接，损伤毛细血管的完整性，从而为肿瘤细胞的转移提供有利条件。

文献表明NF-κB可调控多种血管生成相关因子，包括MMP-2、MMP-9、VEGF、eNOS和Survivin。 恶性肿瘤的生长与转移必需依靠新生血管提供足够的营养才能实现。新生血管既是恶性肿瘤快速增长所必须的先决条件；也是恶性肿瘤远处转移的一个主要步骤和渠道，肿瘤转移的每一步都与肿瘤微血管生成密切相关； 文献表明NF-κB可调控多种血管生成相关因子，包括MMP-2、MMP-9、VEGF、eNOS和Survivin。 以上文献报道结果揭示在特定器官中肿瘤新生血管及前转移微环境的形成对于肿瘤转移至关重要，为研究肿瘤细胞转移的调控机制提供了新的思路。 MMP-2，-9不仅与肿瘤转移密切相关，而且与肿瘤血管生成也有一定相关性。MMP-2，-9在肿瘤中往往表达上调，特别在覅分化恶性肿瘤中。 VEGF作为可悲NF-κB调控的重要血管新生依赖因子，与肿瘤新生血管形成密切相关，一方面VEGF可通过增强血管的通透性引起纤维蛋白原等血浆蛋白的外渗，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网提供最佳基质，另一方面与其受体结合，发挥特异性的内皮细胞分裂原的活性，刺激血管内皮细胞增殖，从而促进血管新生。 eNOS可刺激NO的释放，而NO可激活内皮细胞中PI3K/Akt信号通路，从而促进内皮细胞增殖和动员、迁移和血管形成中起到重要作用。 NF-κB抑制细胞凋亡是通过诱导可组织凋亡进程产物的基因表达来实现的，包括细胞凋亡抑制蛋白（IAP）家族。Survivin是今年发现的凋亡抑制蛋白家族中结构独特的一个新成员，它是肿瘤特异性凋亡抑制因子，高表达与多种肿瘤组织而在正常成人组织中未见表达。血管形成的核心是血管内皮细胞的分裂增殖，有研究表明Survivin参与机体组织中血管生成，促进血管平滑肌的生长，可能是血管形成中生长因子诱导的保护性基因，维持血管内皮细胞的正常增殖。

大黄素（Emodin，1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌）：是从大黄属、蓼属、鼠李属和番泻叶中分离出来的主要有效单体，是一种酪氨酸激酶II抑制剂，其药理作用十分广泛，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等方面的作用。近年来研究表明大黄素在体内外均能抑制多种肿瘤细胞如乳腺癌、肺癌、结直肠癌以及前列腺癌增殖，诱导其凋亡，也能通过诱导肿瘤细胞发生分化或增强肿瘤细胞对化疗药物 的敏感性。 大黄素联合吉西他滨治疗胰腺癌，可通过以下几条途径促进肿瘤细胞凋亡： 抑制NF-κB表达，降低NF-κB对胰腺癌细胞的保护作用，增加胰腺癌的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡； 线粒体途径，通过抑制Bcl-2的表达和促进Bax的表达，降低Bcl-2/Bax，继而促进线粒体Cytochrome C释放，从而导致胰腺癌细胞凋亡； 死亡受体途径，通过激活Caspase-8，-9，最终激活凋亡执行子Caspase-3，导致肿瘤细胞凋亡； Caspase-8活化促进Bid裂解形成tBid活化Bax途径，上调Bax表达，同时抑制Bcl-2，及其下游蛋白Survivin，XIAP等表达，从而起到促凋亡，抗肿瘤作用。

研究内容： 大黄素对TGFβ诱导的前转移微环境相关因子表达的影响：在前转移时期，从蛋白水平和mRNA水平测定空白组、模型组和大黄素组（40mg/kg，腹腔内注射）动物移植瘤组织中Anpgt1,2、MMP2,3,9,10的表达，探究移植瘤组织中血管的通透性的改变与这些因子的关系； 大黄素对TGFβ/Smads信号转导通路的调控研究：制备动物含药血清，测定含药血清对TGFβ诱导的胰腺癌细胞（SW1990）Smad4,7基因表达的影响，从蛋白水平和mRNA水平探讨大黄素对SW1990细胞TGFβ/Smads信号转导通路的调控，明确大黄素对微环境中转移瘤新生血管的调控机制； 前转移微环境对肿瘤细胞的影响及大黄素干预：建立胰腺癌前转移动物模型，腹腔注射SW1990细胞，观察空白组、模型组和大黄素组40mg/kg，腹腔内注射） 动物肿瘤组织中，肿瘤细胞在前转移微环境中肿瘤细胞渗出血管、存活及增殖情况； 大黄素对前转移微循环血管完整性的影响：建立胰腺癌前转移动物模型，并用大黄素进行干预。通过观察空白组、模型组和大黄素组抑制肿瘤血管电镜形态，测定各组血管的通透性，研究大黄素对前转移微环境中血管完整性的研究。

研究内容： 采用b-FGF诱导小鼠腹壁Matrigel种植体方法，通过观察空白组、模型组和大黄素组Matrigel种植体中血红蛋白含量和微血管面积，检测Matrigel种植体内的血管生成情况； 建立裸鼠SW1990胰腺癌转移模型，观察大黄素对转移瘤新生血管的影响：通过观察空白组、模型组、大黄素组移植瘤血管电镜形态，测定各组血管通透性，研究大黄素对前转移微环境中血管完整性的研究。同时应用明胶-氧化铅法血管造影观察裸鼠移植肿瘤血管新生情况； 建立裸鼠SW1990胰腺癌转移模型，采用RT-PCR，Western Blot方法检测大黄素对血管生成相关因子及其途径NF-κB、MMP-2,9、VEGF、eNOS、Survivin、PI3K/Akt的影响。 Matrigel plug assay，基质胶塞实验，该实验方法被广泛用于评价生长因子的促血管新生能力。基质胶是富含层连蛋白的细胞基质，可以诱导和保持多种细胞分化。基质胶在4℃时呈液态，与各种生长刺激因子混合后注射到小鼠腹部皮下组织，在小鼠正常体温条件下很快形成固体凝胶，使生长刺激因子缓慢释放，通过组织学检测，图像分析塞内的血管面积（mm3）或通过检测基质胶中血红蛋白的含量对血管生成进行定量分析。

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