生 物 制 药 工 艺 学 主讲教师： 李再新副教授 谢万如副教授 罗容珍讲 师 四川理工学院 化学与制药工程学院 2010.10

第一章 生物药物概论 Introduction of Biopharmaceutics 1．药物 Medicine(remedy) 用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，按作用有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。按来源有3类：化学药物、生物药物与中草药。 2．药品 Drug 直接用于临床的药物产品，是特殊商品。 药品应规定有适应症、用法与用量和疗程，说明毒副反应。还要有使用有效期，过期药品不准使用。 一定剂型和规格的药物并赋予一定的形式（如包装），而且经过有关部门的批准，有明确的作用用途，才是药品。当然从本质看二者一样都具有相同的属性。但二者也有差别，比如在实验室里正在研究的药物就不能叫药品。

{ 3．中国的三大药源： 生化药物 微生物药物 生物制品 (P1页) 化学药 生物药 中药 中国药典2010年版分一部、二部和三部。 药典一部收载药材及饮片、植物油脂和提取物、成方制剂和单味制剂等； 药典二部收载化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品以及药用辅料等； 药典三部收载生物制品，将《中国生物制品规程》并入药典。 生物制品（biologics），一般指的是用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体病毒等），微生物代谢产物，动物毒素，人或动物的血液或组织等加工制成的预防，治疗和诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂，主要指菌苗、疫苗、毒素、应变原与血液制品等。我国《新生物制品审批办法》对生物制品定义如下：生物制品是应用普通的或以基因工程，细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。

生物药物 Biopharmaceutics 是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学等学科的原理与方法加工制成的药物。 特性：1、药理学特性①药理活性高②针对性强③ 毒副作用小④生理副作用常有 ；2、理化特性：①有效含量低②结构复杂、稳定性差③材料易染菌④ 制剂特殊要求 生物药物（biopharmaceutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。广义的生物药物包括以动物、植物、微生物和海洋生物为原料制取的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物，也包括应用生物工程技术（基因工程、细胞工程、酶工程与发酵工程）制造生产的新生物技术药物（new biotech drug）。 (书：P1页)

生物制品是指用微生物、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗、和诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。

现代生物药物分四大类： （1）重组DNA药物（又称基因工程药物） （2）基因药物：以遗传物质DNA、RNA为物 质基础制造的药物 一般把采用DNA重组技术或单克隆抗体技 术或其他生物技术制造的蛋白质、抗体或核 酸类药物统称为生物技术药物(biotech drug)， 在我国又统称为生物制品。 （3）天然生物药物 （4）合成或半合成生物药物 基因工程药物: 指应用基因工程和蛋白质工程技术制造的重组活性多肽、蛋白质及其修饰物. 基因药物: 这类药物是以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。

生物技术药物 抗癌药物“今又生” (重组人p53腺病毒注射液 ,深圳赛百诺基因技术有限公司 ) 人生长素 人胰岛素 干扰素 表皮生长因子 1.重组DNA药物 2.基因药物 3.天然生物药物 肝素 尿激酶 香菇多糖 维生素 氨基酸 抗生素 4.合成半合成生物药物 氨基酸 半合抗 生物制品是指用微生物、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗和诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。 生化 药物 微生物 药物 海洋 药物 书： P7页

第一节 生物药物的研究范围 一、生物药物的发展简史 1. 传统生物制药技术阶段 第一节 生物药物的研究范围 一、生物药物的发展简史 1. 传统生物制药技术阶段 （Traditional biopharmaceutics）指从生物材料粗加工制成粗制剂阶段。 （1）公元4世纪葛洪《肘后良方》 —海藻治瘿病（地方甲状腺肿） （2）公元631～682，孙思邈 羊肝治“雀目”（VA) 瘿病：颈前结块肿大，与甲状腺肿大有一定关系 雀目：夜盲，因麻雀等某些鸟类系先天夜盲，故又名“雀目”、“雀盲” 秋石：用石膏浸入童便中制成。精致的称为秋冰。

（Recent Biopharmaceutics） 2. 近代生物制药发展阶段 （Recent Biopharmaceutics） （1）脏器制药与微生物制药时期 20世纪20年代：胰岛素、甲状腺素、EAA、EFA、Vit C 20世纪40年代：青霉素 20世纪50年代：皮质激素、垂体激素 20世纪60年代：酶制剂、维生素 （2）生化制药工业时代 60年代后，生物分离工程技术 与设备广泛应用。生化产品达 600多种。 EAA：必须氨基酸 EFA：必须脂肪酸 Vit C： 维生素C 图为胰岛素原

3. 现代生物制药阶段 （Modern Biopharmaceutics） 特点是以基因工程为主导，包括细胞工程、发酵工程、酶工程和组织工程为技术基础。 1982.10重组Ins上市，迄今已有160多种生物技术药物投放市场，369种进入三期临床，760多种进入I-II期，2600多种处于临床前研究。 图为DNA双螺旋模型

二、《生物制药工艺学》的内容 生物制药工艺学 Biopharmaceutical process 1．生化制药与微生物制药工艺； 2．生物技术药物与生物制品制造工艺； 3．相关生物医药产品生产工艺。 课程含三大部分内容： （1）基础篇：生物制药工艺技术基础； （2）技术篇：生物分离工程技术； （3）品种篇：重要生物药物制造工艺。

课程任务：通过学习本门课程应掌握： （1）各类生物药物制造的工艺技术基础理论、原理、工艺过程和制剂技术及其质量控制。 （2）各类生物药物的来源、结构、性质与临床用途。

齐香君：《现代生物制药工艺学》第二版化 学工业出版社， 2004 《生物制药工艺学》主要参考书 齐香君：《现代生物制药工艺学》第二版化 学工业出版社， 2004 吴梧桐:中国药科大学,教授,生物药物研究《实用生物制药》和《现代生化药物学》 吴梧桐：基因工程药物、酶工程药物、天然生化药物 熊宗贵：沈阳药科大学，微生物药物研究 褚志义：上海医科大学，教授，生物合成药物 马清钧：军事医学科学院生物工程研究所，研究员，分子遗传学，生物工程，白介素-2 陈代杰：上海医药工业研究院研究员，微生物药物，环孢菌素A，万古霉素 王军志：中国药品生物制品检定所副所长

3．朱宝全:化学工业出版社《微生物制药技术》，熊宗贵：沈阳药科大学，微生物药物研究 《生物技术制药》，高等教育出版社， 1999 4．褚志义 ：上海医科大学，教授，生物合成药物 《生物合成药物学》，化学工业出版社， 2000.

4．马清钧：军事医学科学院生物工程研究所 《生物技术药物》，中国医药科技出版社 “人重组白细胞介素-2 ”,1994 年6月获得国家一类新药证书和试生产文号.曾获得全国科技大会重大成果奖及国家科技进步一等奖，并多次获得军队科技进步二等奖和三等奖。 马清均:“人重组白细胞介素—2 ”的研制,1994 年6月获得国家一类新药证书和试生产文号.曾获得全国 科技大会重大成果奖及国家科技进步一等奖，并多次获得军队科技进步二等奖和三等奖。

5．吴梧桐《现代生物制药工艺学》 6．王军志：中国药品生物制品检定所副所长 《生物技术药物研究开发和质量控制》，科学出版社，2002年

杂志 1 中国抗生素杂志 2 药物生物技术 3 生物工程学报 4 中国生化药物杂志 5 中国医药工业杂志

第二节 生物药物的性质与类别 一、生物药物的特性 （一）药理学(pharmacology)特性： 1、活性强: 体内存在的天然活性物质。  第二节  生物药物的性质与类别 一、生物药物的特性 （Characterization of Biopharmaceutics） （一）药理学(pharmacology)特性： 1、活性强: 体内存在的天然活性物质。 2、治疗针对性强,基于生理生化机制。 3、毒副作用一般较少，营养价值高。 4、可能具免疫原性或产生过敏反应。

(二)、理化特性： 1. 含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高； 2 (二)、理化特性： 1. 含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高； 2. 组成结构复杂，具严格空间结构，才有生物活性。对多种物理、化学、生物学因素不稳定。 3. 活性高，有效剂量小，对制品的有效性，安全性要严格要求（包括标准品的制订）。

二、生物药物的类别 （一）天然生物药物 1．微生物药物 microbial medicine （1）抗生素 （2）酶抑制剂 （3）免疫抑制剂 (书P11页) （一）天然生物药物 1．微生物药物 microbial medicine （1）抗生素 （2）酶抑制剂 （3）免疫抑制剂 微生物药物：微生物药物是一类特异的天然有机化合物，包括微生物的次级代谢产物，初级代谢产物和微生物结构物质，还包括借助微生物转化（microbial transformation）产生的用化学方法难以全合成的药物或中间体。 抗生素类药物：抗生素是生物（微生物、植物、动物）在其生命活动中产生的，具有抗感染和抗肿瘤作用，在低浓度下能选择性地抑制多种生物功能的有机化学物质。 微生物的初级代谢产物： 初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质,如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。 微生物的次级代谢产物：次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构复杂、对该生物无明显生理功能,或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质,如抗生素、毒素、激素、色素等。 普伐他汀：降血脂

2．生化药物（含海洋药物） （1）氨基酸类药物 （2）多肽类药物 （3）蛋白质类药物 （4）酶类药物 （5）辅酶类药物 （6）核苷酸与核酸类药物 （7）多糖类药物 （8）脂类药物 降钙素：治疗骨质疏松等 天然生化药物是指从生物体（动物、植物和微生物）中获得的天然存在的生化活性物质，其有效成分和化学本质多数比较清楚 （书P13页）

（二）生物技术药物（新生物制品） 1. DNA重组药物（DNA recombinant medicine）－基因工程与蛋白质工程药物 （1）细胞因子干扰素(IFN)类药物 （2）细胞因子白介素类和肿瘤坏 死因子 （3）造血功能药物 （4）生长因子类药物 （5）重组蛋白和多肽类激素 （6）心血管病治疗剂与酶制剂 （7）重组疫苗与治疗性抗体 基因工程(genetic engineering) 是将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。 蛋白质工程(protein engineering) 是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。 基因工程genetic engineering     基因工程是以分子遗传学为理论基础， 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。 1、人生长素（HGH）的天然来源(图为人生长素)     早在二十世纪的20年代的科学家就发现了HGH，直到1958年美国波士顿的新英格兰医学中心的内分泌学家M. Rabem首次将HGH注射到一个体内不产生HGH的小孩，治愈了第一例侏儒症，开创了人生长素的临床应用先例。从此，其它医生也纷纷效仿。 当时治疗这些侏儒症所用的人生长素是从死人的大脑中提取的，一个死人脑垂体只能提取2-3毫克HGH,也就是说治疗一个侏儒症的儿童所需的HGH，要从大量死人大脑中提取，因此HGH在当时非常昂贵。 从脑垂体提取的天然HGH不仅价格昂贵，而且发现了严重的副作用。到了八十年代，美国有3名儿童在接受天然生长素治疗后患上了一种严重疾病:克鲁兹菲尔特-雅各布症（简称CJD），这种病的特征是病人发生进行性痴呆，肌肉失去控制，通常会使病人在发病后5年内死亡。CJD病在英国又称疯牛病，与人食用了患有CJD病的牛肉有关，经科学家研究发现，这是一种病毒性感染疾病，那这种病怎么会与生长素有关呢？原因是非洲人食用了患病的牛肉，这种病毒侵入大脑而死亡，而从非洲死人大脑中提取生长素时，这种病毒也污染了提取出的生长素，而且这种病毒用一般的消毒方法又不能杀灭，从而传染给了用HGH治疗的儿童。到1991年止，在美国5000个用以上制剂治疗的患儿中，有7名儿童患上了CJD症，全世界发现了55名儿童因注射这种垂体来源的HGH而发病。 鉴于CJD病和其它可能感染的病毒的威胁，美国食品和药物管理局(FDA)下令停止生产和销售这种从人脑中提取的天然的人生长素。 2、基因工程重组的人生长素 失去天然提取的来源后，HGH就无法供应了。而临床上又十分需要这类药物。怎么用高效、安全的技术来生产HGH就摆在了科学家面前。 人生长素是蛋白质类荷尔蒙，是脑下垂体分泌的最大蛋白质，由191个氨基酸分子组成，分子量22125道尔顿，这么大分子量的蛋白质很难用通常的多氨合成法来大量生产。基因工程发明人之一，1976年诺贝尔奖金获得者Herbert Boyer和Genetech公司合作，首次用DNA重组技术成功的合成了人生长素，它在生物活性方面与人体分泌的人生长素完全一样。 

2. 基因药物（gene medicine） (1)基因治疗 (P10页) (2)反义核酸药物 (P10页) 基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。 反义药物是以人工合成的10~几十个反义寡核苷酸序列与模板DNA或mRNA互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒作用。 今又生—世界上第一个获得批准的抗肿瘤基因药 　　九十年代初期，美国批准了世界首例抗肿瘤基因治疗的临床实验，2003年中国政府批准了“今又生”上市，批准文号为S20040004，专利申请号：03125129。 　　“今又生”（Gendicine）为国家副主席曾庆红命名，它的药品名称是重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53），性状为淡白色液体。 　　一．结构特征：5型腺病毒载体DNA和人p53基因重组，p53为抗癌基因，腺病毒DNA载体能够有效的将p53基因转入肿瘤细胞内，引起肿瘤细胞凋亡。 　　二．适用范围：1.头颈部鳞癌。 　　　　　　　　　2.肺癌、甲状腺瘤、消化道肿瘤等。

（三）合成或半合成生物药物

第三节 生物药物的发展与展望 1．生物技术药物研究进入蛋白质工程药物时代 第一代重组药物：一级结构与功能和天然活性蛋白质完全一样； 第二代重组药物：对天然产物表达物进行简单修饰，如PEG化或糖基化； 第三代重组药物时代：蛋白质工程药物，在DNA水平上，合理设计、改造、创制新型治疗蛋白。目的是提高活性；减少或消除毒副作用；提高体内外稳定性；产生新的功能特性。 如：快速Ins，B9-Ser→B9-Asp, B27-Thr →B27-Glu 长效Ins, B21-Asn→B21-Gly, B-C末端加入2个Arg，PI由pH5.4→pH6.8

赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins,lispro） 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效Ins ,aspart） 人胰岛素（Insulin） B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32 B30去除；B29修饰 其一是赖脯胰岛素(lispro)，是用基因工程技术将人胰岛素B28位与B29位氨基酸互换；其二是门冬胰岛素(诺和锐，insulin aspart)，则是通过基因工程技术将人胰岛素B28位的脯氨酸替换为门冬氨酸。这些胰岛素类似物不易形成六聚体，皮下注射后主要以单体形式存在，其主要特点为：可溶性，自我结合力较低，皮下注射后局部吸收更快，起效时间更短(10～20分钟)，达峰时间40分钟，作用持续时间3～5小时。这一药物动力学特征更符合生理胰岛素和血糖变化谱，临床实践已经证实，使用速效胰岛素后，餐后血糖平稳，夜间血糖水平高于使用常规人胰岛素组。 长效胰岛素类似物甘精胰岛素(insulin glargine)通过胰岛素分子内氨基酸的置换(A21位门冬氨酸被甘氨酸替代)，且在人胰岛素B链末端增加2个精氨酸，从而改变了等电点(pH 5.4～6.7)。甘精胰岛素在酸性溶液(pH4.0)中呈溶解状态，能保持结构稳定，注射前勿需混悬。注射到皮下组织(中性环境)后，可形成微沉淀物。这种沉淀物的形成使胰岛素的分解、吸收及作用时间延长，可发挥长效作用。但存在的问题是：不能很好地预测沉淀及沉淀物再溶解过程，这些皮下的结晶同样会引起胰岛素吸收不均匀而带来的个体吸收变异。另外，由于其制剂为酸性，易导致注射部位疼痛。循证医学研究证实，与NPH相比，使用甘精胰岛素后吸收变异度有很大改善，但某些患者仍可表现为变异度偏大。 长效胰岛素类似物地特胰岛素(insulin detemir，Levemir)运用的是另一原理：由于药物的分子量越大，在皮下的扩散速度和穿过毛细血管壁的速度越慢，因此可以通过加大胰岛素分子的方法制备长效可溶性胰岛素类似物。目前的制备技术有2种：一种是使胰岛素分子与大分子蛋白结合，另一种是增加胰岛素分子间的交联。当然也可以将2种方法联合应用。地特胰岛素所使用的是前者，其去除了人胰岛素B30位的氨基酸，并在B29位的赖氨酸上增加了一个肉豆蔻酸侧链。在有锌离子存在的药液中，胰岛素分子仍以六聚体形式存在，而C14-脂肪酸链的修饰会使六聚体在皮下组织的扩散和吸收减慢。在单体状态下，含有C14-的脂肪酸链又会与白蛋白结合，进一步减慢吸收入血循环的速度。在血浆中，98%～ 99%的地特胰岛素与白蛋白结合，因此，向靶组织的扩散也较未结合白蛋白的胰岛素要慢。本品已于2004年在欧洲上市。 猪胰岛素 牛胰岛素 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins,lispro） 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效Ins ,aspart） 甘精胰岛素 (安万特公司、长效Ins,glargine) 地特胰岛素 (诺和诺德公司、长效Ins）

3D Structure of Insulin 胰岛素二聚体（dimer） 胰岛素六聚体（hexamer ）

2. 治疗性抗体发展迅猛 FDA已批准17种治疗性抗体，在抗肿瘤、治疗风湿性关节炎，防止感染、抗血小板凝集等方面疗效突出。在369种进入临床试验的生物技术药物中有75种是抗体类产品，2008年有10余种上市。如抗TNFα嵌合抗体，TNFα-R-Fc融合蛋白。

抗体人源化分为 （1）嵌合抗体：用人源抗体恒定区替换鼠源抗体恒定区，保留抗体可变区。 （2）人源化抗体:可变区中仅CDR（互补决定区）为鼠源，其FR(框架区)及恒定区均来自人源。

曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。此抗体属IgGl型，含人的框架区，及能与HER-2结合的鼠抗-p185 HER2抗体的互补决定区。 人源化的抗HER2抗体是由悬养于无菌培养基中的哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞CHO)产生的，用亲合色谱法和离子交换法纯化，包括特殊的病毒灭活的去除程序。 HER2原癌基因或C-erbB2编码一个单一的受体样跨膜蛋白，分子量185kDa，其结构上与表皮生长因子受体相关。在原发性乳腺癌患者中观察到有25%-30%的患者HER2过度表达。HER2基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面HER2蛋白表达增加，导致HER2受体活化。

3. 哺乳动物细胞表达产物所占比重快速增加 2000年已批准创新生物技术药物：酵母表达产品2种，E. coli表达产品4种，分子量均在3 3. 哺乳动物细胞表达产物所占比重快速增加 2000年已批准创新生物技术药物：酵母表达产品2种，E.coli表达产品4种，分子量均在3.5KDa~6KDa,表示它表达多肽有优势，而通过动物细胞表达系统22种（包括抗体、酶、凝血因子）如： TNKase(组织纤溶酶原激活剂,t-pA突变体）； EPO（促红细胞生成素)

4、RNA干涉（RNAi）RNA interference 是指在生物体细胞内，dsRNA(双链RNA)引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。 一种转录后水平的基因沉默 生物体内普遍存在 抵御外在感染的重要保护机制 RNAi对辅修班不做要求 siRNA是一种能用于沉默基因关闭有害蛋白制造的伟大技术。鉴于siRNA在哺乳动物细胞上抑制基因表达的卓越性能,利用siRNA开发抗肿瘤、抗病毒等药物的工作也已经开始,已有临床实验。

siRNA (small interfering RNA) ：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。siRNA是siRISC (RNA-induced silencing complex,由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

RNAi引发的基因沉默机制 ssRNA: 单链RNA dsRNA: 双链RNA RdRP: 依赖RNA的RNA聚合酶 Dicer:RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶） RISC: RNA-induced silencing complex RNA诱导的沉默复合体 Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。 siRNA原理: RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex （RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。 siRNA有如下特点： 1. 长度约在22nt左右。 2. 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。 3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。 4. 是RISC组分。 5. siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。 6. siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。 7. 结构上， siRNA是双链RNA。 8. 在Dicer酶的加工过程中， siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。 9. 在作用位置上， siRNA可作用于mRNA的任何部位。 10. 在作用方式上， siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。 11. siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。 Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.

5、基因治疗剂： DNA疫苗与基因药物发展迅速，将功能基因与表达载体重组，导入人体细胞，使其在体内表达活性蛋白，产生免疫或治疗作用。已研究成功乳腺癌DNA疫苗（可能对病毒性肿瘤均可获得成功），还有黑色瘤基因治疗也取得突破（使病人晚期肿瘤消失），将病人的T-cell分离出来，用肿瘤抗原受体基因改造T-cell，再注入人体，可以对黑色素瘤产生有效清除作用。 基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。