生物去污：通过途径工程净化环境 张晓辉 10808040

途径工程(Pathway Engineering)

途径工程是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。途径工程在分析代谢途径的基础上，定性地改变细胞内代谢流走向，调整原有代谢网络，进而提高特定代谢物的产量。外源基因的准确导入及其编码蛋白的稳定表达，可以拓展细胞内现有代谢途径的延伸路线，以获得新的生物活性物质或者优良的遗传特征。

生物去污的优点： 1）条件温和； 2）成本低； 3）有一定的专一性和可选择性； 4）比较彻底，几乎无二次污染； 5）可以解决传统方法无法解决的污染； 。。。。。。。。。。。

许多微生物天生就具有这种降解、转化，或者螯合各种毒性化学药物的能力，但效率都比较低。所以有必要通过途径工程对这些微生物进行操作或改造，提高其去污的能力，进而实现去污的目的。

Pathway engineering for enhanced bioremediation Inorganic pollutant removal

1、一些重金属污染的生物去除 当遇到重金属时，大多数微生物都会做出反应产生金属鳌合肽 ，比如植物螯合肽（PCs）和金属硫蛋白（MTs） 植物螯合素的化学结构示意图 金属硫蛋白（MT）生命蛋

在大肠杆菌里使负责PC合成的拟南芥植物螯合肽合成酶（AtPCS）过表达，使金属堆积提高到20倍。 类似成就还有在共生根瘤菌细菌中。

但合成PC的前体物质谷胱甘肽（GSH）的限制成了重金属的堆积的瓶颈。 解决方法： 1）共表达负责产生GSH的酶，结果PC的合成增加了10倍 ； 2）通过在能够提供足够的GSH的啤酒酵母中表达PC合酶 。

另外，MTs和PCs的一个特点是非选择性结合各种重金属。 解决方法： 1）改造特定重金属的转运体 2）提高吸收的能力 3) 利用在特定的金属污染场所自然突变的金属结合MTs

金属调节蛋白在去除重金属污染中也发挥着重要的作用，通过设计提高其高亲和性和自然选择性，并应用到汞和砷的特异聚集中。 通常两个MerR单体形成一个简单的多肽，然后再组成一个极其小的MerR结构域，即使这样极其小的结构域也被设计成高亲和地结合汞。其他酶涉及的抵抗途径，比如汞还原酶，通过连接一种磷酸盐聚合体聚磷酸酯也被用于有机无机汞的去除

2、放射性污染的生物去除 自然存在的高耐受放射的细菌是提高放射 性污染净化的理想代谢设计候选对象 。

Brim等第一次报道使用极端放射耐受和嗜热细菌Deinococcus geothemalis通过编码表达大肠杆菌里的mer操纵子实现对Hg2+的还原。这种工程菌能够在较高温度和电离辐射下还原汞。而其还能还原Fe(Ⅲ)，U(Ⅵ)和Cr(Ⅵ)。

在P. aeruginosa中通过多聚磷酸激酶和外切聚磷酸酶的过表达，聚磷酸酯也能使放射物以金属磷酸盐的形式凝结 最近一种非特异磷酸酯酶phoN在放射耐受性细菌D. radiodurans中获得表达，使铀从稀释的核废料中生物凝结 。

定向诱导也被用来改善铬酸盐和铀酰还原酶的酶效率。 在 E. coli和 P. putida中设计酶的表达显示出改良后的酶的动力学。在放射耐受性微生物表达过程中这些改良的酶很明显能够进一步提高放射物凝结效率。

Engineered microbes for organic chemical removal 有机化合物的去除之改造微生物

磷酸二乙硝苯酯 硝苯硫酸酯 甲基硝苯硫酸酯 二苯酰硫胺素 有机污染主要有：有机磷酸盐（OPs）；有机硫化合物和硝基芳香族化合物。 磷酸二乙硝苯酯 硝苯硫酸酯 甲基硝苯硫酸酯 有机污染主要有：有机磷酸盐（OPs）；有机硫化合物和硝基芳香族化合物。 有机污染物的生物去污包括提高这些化合物的降解，使它们转化成低毒或无毒的产物。 微生物已经被改造用来降低和利用这些有机化合物 。 二苯酰硫胺素

1、有机磷酸盐（OPs）的生物去除 有机磷酸酯水解酶（OPH）具有降解Ops的能力。OPH能够催化P-O键的水解，释放p-硝基酚基团。

可以应用基因工程技术如DNA同源重组技术，定向诱导，或者错位PCR技术来提高OPH的催化活性和底物专一性。

另外，运用细胞表面酶的易位，并通过解除Ops通过细胞膜的转换瓶颈增强生物解毒的效率。 运用Lpp(lipoprotein脂蛋白)–OmpA (outer membrane protein A外膜蛋白A) 系统将OPH释放到大肠杆菌表面，使硝苯硫酸酯的降解比OPH在细胞内表达要快7倍。目前，探索OPH分泌到细胞膜间隙的工作也已开展，以全面提高其水解效率。

尽管一些Ops能够初始水解转化成一些低毒的p-硝基苯(PNP)和二烃基磷酸盐，但这些降解产物依然含有毒性，抵抗生物降解。

一种能够水解硝苯硫酸酯和二乙基硫代硫酸酯的改造的大肠杆菌和具有天然降解PNP的Pseudomonas putida恶臭假单胞菌结合培养能够顺利分解硝苯硫磷酯，且没有PNP的积累。

改造的Moraxella sp摩拉克式菌属或者P 改造的Moraxella sp摩拉克式菌属或者P. putida（Pseudomonas putida恶臭假单胞菌）也能自然地降低PNP。在前者中，OPH在细胞表面被表达，并证明能够同时降解硝苯硫磷酯，甲基硝苯硫磷酯和二乙硝苯磷酸酯，且它们的水解产物都是PNP。在后者中，运用了一个P. putida菌株，其包含一个固有的PNP降解操纵子。 （矿化作用是在土壤微生物作用下 ，土壤中有机态化合物转化为无机态化合物过程的总称）

在P. putida菌株中引入一个表达OPH，磷酸二酯酶（Pde）和碱性磷酸酶（PhoA）的合成操纵子能够水解Ops和矿化二乙基磷酸盐，分别在24小时，78小时和142小时能完全降解二乙硝苯磷酸酯，PNP和DEP。

2、有机硫化合物的生物去除 有机硫化合物中二苯酰硫胺素（DBT）是最多的一种分子 最近在脱硫作用的研究主要关注在运用微生物的生物改造方面 。

DBT的生物脱硫作用需要一系列的酶 限速步骤 第一个酶是dibenzothiophene单加氧酶（DszC），它能够转化DET成DBT sulfone (DBTO2)。第二个酶是dibenzothiophene-5,5-dioxide monooxygenase (DszA)，负责DBTO2 转化成 2-hydroxybiphenyl-2-sulfinate (HBPS)，2-hydroxybiphenyl-2-sulfinate sulfinolyase (DszB)则催化HBPS转化成 2-hydroxybiphenyl (HBP) 和亚硫酸盐。 限速步骤

可以通过改造DszB基因5‘非编码区获得DszB的高表达。这种合成的突变体的脱硫作用效率相对DszB在细胞自然表达提高了9倍。

Li等报道了另一项关于DszB改良的研究。正常的dsz 操纵子表现特征显示dszA, dszB和 dszC的mRNA比率是11:3 Li等报道了另一项关于DszB改良的研究。正常的dsz 操纵子表现特征显示dszA, dszB和 dszC的mRNA比率是11:3.3:1，但是DszB的酶水平最低。这是由于DszA的终止密码子和DszB的起始密码子交错重叠所致。为了获得稳定的DszB的表达，插入含有可能的核糖体结合位点的序列对这种酶进行重新设计，结果，改造操纵子的细胞的表达是没改造操纵子的5倍高，整个脱硫的活性提高了12倍。

3、硝基芳香族化合物的生物去除 Nitroaromatic（硝基芳香族）化合物如硝基苯和硝基甲苯 然而，由于硝基的毒性和electron-withdrawing（电荷中和）效应，使得生物降解的效率非常低。尽管矿化硝基苯、硝基甲苯和二硝基甲苯的细菌菌株得到分离，涉及到生物降解途径的酶也被阐明，但是这些缺乏专一性的酶使得自然降解只能在很低的速度下进行。

1,2-dioxygenase（1，2-双加氧酶）,它能催化硝基苯转化成邻苯二酚和亚硝酸盐。对这种酶活性位点附近部分293 (F293Q)进行氨基酸取代扩展了酶的底物专一性，结果对2，6二硝基甲苯的氧化作用速率快了2.5倍。 1,2-dioxygenase（1，2-双加氧酶）,它能催化硝基苯转化成邻苯二酚和亚硝酸盐。对这种酶活性位点附近部分进行修改来调控酶的底物特异性。在酶的293 (F293Q)的氨基酸取代扩展了酶的底物专一性，结果对2，6二硝基甲苯的氧化作用速率快了2.5倍。 同样的方法还用在2-硝基甲苯双加氧酶，这种酶负责氧化硝基甲苯成3-甲基邻苯二酚和亚硝酸盐。活性位点258 (N258V)附近区域选择性定向诱变和取代很显著地改变 enantiospecificity底物专一性。

同样的方法还用在2-硝基甲苯双加氧酶，这种酶负责氧化硝基甲苯成3-甲基邻苯二酚和亚硝酸盐。活性位点258 (N258V)附近区域选择性定向诱变和取代很显著地改变底物专一性。

2，4-二硝基甲苯双加氧酶(DNTDO)是另外一种酶，分解代谢2，4-二硝基甲苯成4-甲基-5-硝基邻苯二酚和亚硝酸盐。对DNTDO的 I204位置进行突变扩大了其底物特异性。通过饱和诱变，获得了针对二硝基甲苯(DNTs) 如 2,3-DNT, 2,5-DNT, 2,6-DNT,2NT和4NT的显著的改良。 这种酶是一种复合酶系统，包含黄素蛋白还原酶，铁硫铁氧还蛋白，以及α和β亚基。

DNT降解的起始产物4-甲基-5-硝基邻苯二酚，通过MNC双加氧酶（如图）的作用转变成2-羟基-5-甲基苯醌。MNC双加氧酶具有较窄的底物特异性，只能结合MNC和4-硝基邻苯二酚。通过设计得到(M22L/L380I)两个区域的突变体，结果能够转化4-硝基邻苯二酚和3-甲基-4-硝基邻苯二酚，对4-硝基邻苯二酚的降解效率比野生型酶高出11倍。

基因组重排技术也被用来探索另外一种重要的杀虫剂五氯苯酚（PCP）的生物降解。其中，获得的一些突变菌株能够完全降解PCP。 另外，全面的基因组技术像全功能基因组学，生理学分析和模型建立能够获得增强型微生物，在多重水平上拥有最优的生物降解途径能力。

目前。寻找新的有毒化学物的降解酶及其降解途径非常热门，炸药降解P450系统在降解高毒性炸药hexa-hydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine(RDX)中显示出了其特征性。新发现的XplA和XplB，在Arabidopsis中高表达时，使得RDX快速地被移除。 这个普遍的方法，被运用到其他改造的降解微生物中，然而，通过这些超级通道的能量依赖型转运的运用可能受到限制。

另外一种感兴趣的方法是从Sphingomonas sp. A1中开发专一性的膜结构“高通道”，增强污染物的吸收。在S 另外一种感兴趣的方法是从Sphingomonas sp. A1中开发专一性的膜结构“高通道”，增强污染物的吸收。在S. wittichii RW1降解二噁英和在S. subarctica IFO 16058T降解聚丙烯乙二醇中这些高通道的引入导致生物去污能力实质性增强。

Conclusion 各种分子，基因和代谢工程方法的研究加速了生物去污的发展，产生各种用于生物净化进程的专一性设计的微生物。基于生物去污途径，关键酶的结构及功能知识，以及自然解毒微生物多方面分子鉴定等知识库的扩展将会进一步促进设计一种新的生物去污方法的进程。

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