1.2 基因工程的基本操作程序 善假于物也

补：原核细胞的基因结构 非编码区 编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 与RNA聚酶结合位点 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。

原核细胞的 基因结构 编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 ①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。 非编码区 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。

补：真核细胞的基因结构 外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA 非编码区 编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 与RNA聚酶 结合位点 外显子 内含子 外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA

真核细胞的 基因结构 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 编码区 非编码区 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。 非编码序列： 包括非编码区和内含子

都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 不一样.真核细胞基因结构要长一些.

基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定

一、目的基因的获取 1、目的基因的来源 ①从自然界已有的物种分离 ②人工方法合成 2、目的基因主要是指______________________ 编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 目前被广泛提取使用的有：苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。 3、获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成

(1)从基因文库中获取目的基因 什么是基因文库？ 什么是部分基因文库？ 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 目的基因的有关信息与什么相联系？

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。 基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 概念：基因文库 （gene library） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

基因组文库: 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.

思考：基因文库如何构建？ 1)基因组文库的构建 基因组DNA 限制酶 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。此种构建基因文库的方法称直接分离法（或鸟枪法）。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 基因重组 体外包装 转化细菌

mRNA 2)cDNA文库的构建 反转录酶 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。此种构建基因文库的方法称反转录法。 cDNA 基因重组

基因组DNA文库与cDNA文库构建的比较

基因组文库与部分基因文库的关系 DUCK179制作

思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。

A C 1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库 C

(二)利用PCR技术扩增

(2)利用PCR技术扩增 聚合酶链式反应 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 体外 特定DNA片段 ②原理：__________ DNA复制 已知基因的核苷酸序列 ③条件：_______________________、 _______________、___________ (做启动子)、 ___________. 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） 2n ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增

⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ 氢键 单链DNA b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 双链 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→ 3′ 端延伸，合成与模板互补的________。 DNA链

PCR原理 5/ 3/ G—G T—C 变性 复性 5/ 3/ A—G 引物Ⅰ 延伸 3/ 5/ G—A C—C 5/ 3/ G—G 引物Ⅱ

PCR(多聚酶链式反应)

1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 ①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温 A．①③④⑦⑧⑨ B．①②④⑥⑦⑧ C．①②⑤⑥⑦⑨ D．①③⑤⑥⑦⑧ D 2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个 B

（3）人工合成：若基因_____，核苷酸序列又 ______ ，则可用此法。 已知 较小 （3）人工合成：若基因_____，核苷酸序列又 ______ ，则可用此法。 已知 肽链氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 推测 化学合成法

A D 1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ D

2、基因表达载体的构建 —— 核心 ①用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 ②用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同 的黏性末端 ③将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 切口 DNA连接酶

2、基因表达载体的构建 —— 核心 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种

经此过程，基因表达载体的构建就成功了？ 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？

不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。

它们有什么作用？ 基因表达载体的组成： a、目的基因 位于基因的首端,是mRNA结合位点 b、启动子 位于基因的末端,终止转录 c、终止子 d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞 它们有什么作用？

注意 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。

A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因 1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别 A

3、将目的基因导入受体细胞 转化 —— 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 农杆菌转化法 将目的基因导入 植物细胞 基因枪法 花粉管通道法 方法 将目的基因导入 动物细胞 ——显微注射法 将目的基因导入 微生物细胞 ——Ca2+处理法

3、将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径

1、将目的基因导入植物细胞 特点: （1）农杆菌转化法 转化过程: 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 （1）农杆菌转化法 转化过程: 表达载体 农杆菌 植物细胞 新性状 Ti质粒 目的基因 转入 导入 插入 植物细胞染色DNA 构建 表达

（2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

（3）花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射法 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 显微注射 移植到子宫 取受精卵 受精卵发育 新性状动物

3、将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理大肠杆菌 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞

导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？ 所以要对受体细胞作怎样的处理？ 对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测 怎样进行检测？ 通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测

B D C 1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A．结构简单、操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少、简单 D．性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④ B D 3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达 C

C 8. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 ①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ C

4、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 检测— ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 Go on

知识延伸——DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。

a DNA 变性 DNA杂交 （如检测SARS病毒等） b 附着在膜上 c 硝化纤维素 报告基因（含荧光素分子） 加探针 d 返 回

归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：

求异思维 你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？     反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以5′→3′方向合成DNA。     cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

寻根问底 1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。

2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？ 有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。

思考与探究： 1.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； ②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

2.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

3.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？ 基本操作如下：     （1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。     （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。     （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。     （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

练习 C 1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来

练习 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D

练习 A 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶

练习 D 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

练习 C 5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C