考点 32 基因工程

案例 基因工程农药 　　美国一家公司把Bt毒素基因，转移到假单胞菌中，生产出两种基因工程农药，将其喷洒到农作物上，害虫吸入便死亡。科学家们把Bt的杀虫毒素基因导入寄生在水稻植株组织中的一种细菌———脓杆菌中，再将获得的重组细菌利用高压封入玉米和水稻的种子内。随着作物的生长，重组菌在植株组织内增殖，害虫在咬食植物时也将这些细菌吞下，从而被杀死。该公司称这种微生物制剂为“植物疫苗”。 任务1 写出培养“植物疫苗”基本步骤

任务2 一、获取目的基因(Bt毒素基因) 写出获取目的基因的方法，使用何种工具 序列未知：1、基因文库法 基因组文库： 含有一种生物的全部基因 部分基因文库 含有一种生物的部分基因 工具——限制性（核酸）内切酶（限制酶） （1）来源： 主要是微生物)，能将外来的DNA切断，是在DNA分子内部进行的 （2）作用：切割外源DNA，使之失效，保护自身 （3）特点： 一种酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割磷酸二酯键。 专一性

限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 回纹序列 限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接

平齐末端 限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点

基因组文库 cDNA文库 cDNA library 这个群体包含全基因组的遗传信息 cDNA文库 cDNA library 以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementary DNA，cDNA) 将双链cDNA与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库

变性 复性 延伸 2、PCR技术扩增——聚合酶链式反应 前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列 条件： 原料、模板、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶）温度控制 变性 1.目的基因DNA受热变性，解链； 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。 复性 延伸

3、化学方法合成目的基因 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 合成 双链DNA 化学合成 合成 双链DNA (即目的基因) 反转录 单链DNA (cDNA） 目的基因的mRNA

优点 缺点 基因文库 反转录法 根据已知氨基酸合成DNA法 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 操作简便广泛使用 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 专一性最强

—— 核心 二、形成重组DNA分子 质粒 DNA分子 同一种 限制酶 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。

目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的组成： a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

任务3 工具——运载体/载体 写出常用的运载体、作为运载体的条件和作用 1、常用载体：质粒、噬菌体或某些动植物病毒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。 2、作用： 将外源基因转移到受体细胞中去。 在受体细胞的复制内，对外源基因(目的基因)进行大量复制。

作为运载体必须具备的条件 1）能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。 2）具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 4）必需是安全的，不会对受体细胞有害。 5）大小应适合，便于提取和操作

（2）噬菌体载体 1、噬菌体； 2、噬菌体DNA； 3、噬菌体DNA中间 基因簇； 4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）

工具——DNA连接酶 将双链DNA片段（扶手的断口）“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷之间的磷酸二酯键。 任务4 比较各种不同的酶

名 称 作 用 参与生理过程及应用 DNA连接酶 限制性酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 解旋酶 逆转录酶 名 称 作 用 参与生理过程及应用 名 称 作 用 参与生理过程及应用 作用 位点 DNA连接酶 限制性酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 解旋酶 逆转录酶 名 称 作 用 参与生理过程及应用 作用 位点 DNA连接酶 连接两个DNA片段 基因工程 a 限制性酶 切割特定的脱氧核苷酸序列 DNA聚合酶 在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧核苷酸 DNA复制 RNA聚合酶 在核苷酸链上添加单个核苷酸 转录 解旋酶 使碱基间氢键断裂形成单脱氧核苷酸链 DNA复制及转录 b 逆转录酶 以RNA为模板合成DNA 逆转录、基因工程 作用位点示意图

三、将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受体细胞 转化过程 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法 体细胞 原核细胞 受精卵 目的基因插入TI质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

(wu)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 检测内容 检测方法 具体方法 外源DNA是否插入受体细胞染色体上 目的基因是否转录出mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 从生物体内提取DNA，用同位素或者荧光分子标记的目的基因，与之杂交 DNA分子杂交 DNA分子杂交 从生物体内提取mRNA，用标记的核苷酸链与之杂交 分子水平： 抗原—抗体杂交 从转基因生物内提取蛋白质与相应抗体杂交 抗虫、抗病的接种实验，与普通生物进行比较，检测是否有差异 个体水平：生物学功能鉴定

案例 丈夫家族有乳腺癌遗传病史，其外祖母、母亲、阿姨和表姐都在20岁左右诊断出了这种致命疾病。由于是乳腺癌基因携带者，要是这对夫妻自然怀孕，他们的儿子携带这种致命基因的几率是50%，并且患前列腺癌的几率大大提高。如果生出来的是女孩，其患上乳腺癌的几率是80%，患卵巢癌的几率是60%. 为了使孩子免受遗传性疾病威胁，这对夫妇决定在孩子出生前就为其“免疫”。 任务5 该采取什么措施？写出解决问题的大致思路/步骤

获取受精卵 母亲 父亲 服药促排卵子 超数排卵 获能的精子 成熟的卵细胞 体外受精 15个受精卵 八个细胞胚 取出一个细胞

基因筛查 基因诊断是用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。 正常基因作探针 异常基因作探针 1、制作基因探针 2、将待测基因加热成单链 3、两者混合杂交 点杂交 点杂交 正常人 患者 DNA DNA 正常人 患者 DNA DNA 正常胚胎移植

1、（2008·泰安期末）我国科学家在一植物中发现了某种抗虫基因，采用转基因 技术将此抗虫基因转移到玉米中，培育抗虫玉米新品种。请回答： （1）右图示提取抗虫基因过程中某操作环节，箭头表示的切割位置，据图分析： 切断a处的工具酶是 ，写出切割产生的DNA片断黏性末端：   （2）基因表达载体的构建是实施基因工程的关键一步， 需通过 将切割产生的抗虫基因的黏性末端与运 载体的黏性末端结合起来。基因表达载体除了具有抗虫 基因外，还必须有标记基因，该标记基因的作用 是: （3）将基因表达载体导入玉米细胞后，可通过 技术检测玉米体内是否含有抗虫基因，检测抗虫基因是否表达最直接的方法是 。 (4)假如采用蛋白质工程技术提高玉米抗虫蛋白的抗虫效能，首先要做 到 。 限制性内切酶 ……G ACGTC …… …… CTGCA C…… DNA连接酶 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 DNA分子杂交 让多种害虫食用该玉米的茎、叶等 从预期的抗虫蛋白质功能出发，设计预期的抗虫蛋白质结构 答案：第1题 第2题 第3题 第4题

2、（2008 ·澄海区模拟）科学家通过基因工程，成功培育出能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉，其过程大致如图所示。 (1)细菌的基因能“嫁接”到棉 花细胞内，原因是：① ② (2)上述过程中，将目的基因导 入棉花细胞内使用 法， 这种导入方法较经济、有效。目 的基因能否在棉株体内稳定维持 和表达其遗传特性的关键 是 ， 还需要通过检测才能知道，检测 采用的方法是 。 (3) 利用基因工程技术培育抗虫棉，相比诱变育种和传统的杂交育种方法，具有 和 等突出的优点，但是目前基因工程仍不能取代传统的杂交育种和诱变育种。与基因工程技术相比，杂交育种和诱变育种方法主要具有 的优点。 (4) 某棉农在食用该抗虫棉种子压榨的棉籽油炒芹菜后，出现鼻塞流涕，皮肤骚痒难忍症状。停用一段时间后这些症状会自然消失，该现象很可能是 。 组成细菌和 植物的DNA分子的空间结构和化学组成相同 有互补的碱基序列 农杆菌转化 目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上 DNA分子杂交技术 能有效地打破物种的生殖隔离 定向改变生物性状 操作简便易行 过敏反应 答案：第（1）题 第（2）题 第（3）题 第（4）题

3、(2008·南通基础调研)番茄营养丰富，是人们喜爱的一类果蔬。但普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因， 控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐贮藏。为满足人们的生 产生活需要，科学家们通过基因工程技术，培育出了抗软化、保鲜时间长的番茄新品种。 操作流程如图，请回答： (1)过程①需要的工具酶有限制性内切酶和__________________。 (2)在构建基因表达载体时，重组DNA中除插入目的基因外，还需要有______________、终止子以及_______________________。 (3)在番茄新品种的培育过程中，将目的基因导入受体细胞的方法叫做______________ (4)从图中可见，mRNAl和mRNA2的结合直接导致了__________________无法合成，最终使番茄获得了抗软化的性状。 (5)普通番茄细胞导入目的基因后，经③过程形成_______________，然后诱导出试管苗，进一步培养成正常植株。 DNA连接酶 启动子 标记基因 农杆菌转化法 聚半乳糖醛酸酶 愈伤组织 答案：第（1）题 第（2）题 第（3）题 第（4）题 第（5）题

①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 检测— ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— (四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 检测— ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— DNA分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原-抗体杂交 鉴定— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等

四 基因工程的操作流程和应用 获取目的基因 1．基因工程的操作流程 构建基因表达载体 四 基因工程的操作流程和应用 1．基因工程的操作流程 获取目的基因 构建基因表达载体 用同一种限制酶去切割质粒和目的基因，加入DNA连接酶，形成重组DNA 将目的基因导入受体细胞 借鉴细菌或病毒侵染细胞的方法来进行 目的基因检测与鉴定 从供体细胞的DNA中分离提取 方法 合成 双链DNA（基因） 单链DNA mRNA 反转录法： 反转录 人工合成 基因 据已知的氨基 酸序列合成： 氨基酸 序列 推测 mRNA 反转录 单链DNA 合成 基因 外源DNA是否插入受体细胞染色体上 DNA分子杂交 从生物体内提取DNA，用同位素或者荧光分子标记的目的基因，与之杂交 目的基因是否转录出mRNA 从生物体内提取mRNA，用标记的核苷酸链与之杂交 目的基因是否翻译出蛋白质 分子水平 抗原—抗体杂交：从转基因生物内提取蛋白质与相应抗体杂交 个体水平鉴定 抗虫、抗病的接种实验，与普通生物进行比较，检测是否有差异 提问：基因工程操作里面的核心步骤是？ 构建基因表达载体 27