第11章 高效液相色谱分析法 11.1各类高效液相色谱法 11.2 高效液相色谱仪 高效液相色谱的特点与仪器 第11章 高效液相色谱分析法 （high performance liquid chromatograph） 高效液相色谱的特点与仪器 （feature and instrument of HPLC） 11.1各类高效液相色谱法 11.2 高效液相色谱仪 2017/3/12

§11.1 各类高效液相色谱法 一、液固吸附色谱分析法（LSC） 二、液液分配色谱分析法（LLC） 三、化学键合相色谱分析法（BPC）

一、液固吸附色谱分析法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂 1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异。 分离前提：K不等或k不等

2. 固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm） （1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG 5~6μm 5×104 球形 YQG 3~4μm 8×108 堆积硅珠 YQG 3~4 μm 8×108 理想 原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物 （2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物

3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - - 4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液

二、液液分配色谱分析法（LLC） 1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性→NLLC 固定液——非极性→RLLC 3．正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分

三、化学键合相色谱法（BPC） （一）化学键合相 （二）反相键合相色谱 （三）正相键合相色谱 （四）离子对色谱和离子抑制色谱

（一）化学键合相 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1．分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2．特点： （1）不易流失 （2）热稳定性好 （3）化学性能好 （4）载样量大 （5）适于梯度洗脱阿

（二）反相键合相色谱 1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑ k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓ k↓，组分tR↓ 2．固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题） 3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF

4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 5．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）

（三）正相键合相色谱 1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作 用力、诱导力、或氢键作用力 2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3．流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇

4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 5．出柱顺序： 结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱 6．适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等

（四）离子对色谱和离子抑制色谱 1．反相离子对色谱法 2．反相离子抑制色谱

1．反相离子对色谱法（IPC或PIC） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。 （1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→分析酸 （2）影响k的因素 a．与m的极性有关（同反相色谱） b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ （3）适用：较强的有机酸、碱

2．反相离子抑制色谱 在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的。 （1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 （2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质——加入酸HAc tR↑，k↑ 碱性物质——加入碱NH3·H2O tR↑，k↑ 调节pH范围：3.0~8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 腐蚀柱子 （3）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物

§11.2 高效液相色谱仪 high performance liquid chromatograph 2017/3/12

2017/3/12

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一、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 2017/3/12

二、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC 1.流程 2017/3/12

2.主要部件 （动画） (1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 （动画） 2017/3/12

(2)梯度淋洗装置 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 2017/3/12

(3) 进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示： 2017/3/12

(4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 2017/3/12

(5) 液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 2017/3/12

b. 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 2017/3/12

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光电二极管阵列检测器 2017/3/12

c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种； 2017/3/12

示差折光检测器 2017/3/12

d. 荧光检测器 （fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 2017/3/12