色谱分析 应用化学系

高效液相色谱的色谱柱和流动相

色谱柱 HPLC柱填料 1、全多孔球形硅胶填料最为普遍 硅胶基质分为微孔(小于2nm)，中孔(2-50nm)，大孔(大于50nm)硅胶，多用中孔和大孔硅胶填料 2、其它金属氧化物基质填料 TiO2、Zr O2、高分子聚合物等基质的填料，能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。

硅胶色谱柱填料的优势 硅胶有良好的机械强度 硅胶的孔结构和比表面积容易控制 硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性 硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰

硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应 碱性分析物严重拖尾，分离度低。 加入碱性流动相 添加剂抑制

反相色谱柱填料保留性能随温度的变化 lnk’与1/T在一定温度范围内呈线性关系

提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能 提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料 对硅胶进行充分封端（尾） 利用空间位阻掩蔽残余硅羟基 键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、酰胺基） 双齿键合相

高效液相色谱的流动相 常用反相色谱流动相：甲醇-水、乙腈-水 常用正相色谱流动相：正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇、正己烷-四氢呋喃 常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化钠 需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的吸收强弱，溶剂紫外截止波长见表9-4。

高效液相色谱方法的选择 反相色谱可以分析多数样品。 极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留很弱，难以有效分离，可以用正相色谱（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂-水流动相分离。 弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离。 分析离子，首选离子色谱。 生物分子的分离模式有反相、离子交换、体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式。

色谱条件的影响 色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越小分离度越高。 柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离度越大，但柱压越高（5μm到3μm柱效提高30%柱压却升高1倍）。 流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留减弱。 流速越高，保留时间越短，但柱压液越高。 柱温越高，保留时间越短，分离度有所降低。 在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱峰形时，可以进行梯度洗脱。

40度 169bar 90度 94bar

SB-C8 4.6X75mm 3.5um 866953-906 流通池: 5mm, 2.5uL 20~60%B (10min.) 2mL/min. SB-C8 4.6X150mm 5um 883975-906 流通池: 10mm, 8uL 20~60%B (30min.) 1mL/min.

5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm 3.5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm

-CN -苯基 C8

液相色谱键合相的类型和色谱性质的主要影响因素

高效液相色谱键合固定相的类型 主要有四类： 硅-氧-碳键型固定相 硅-氮-碳键型固定相 硅-氧-硅-碳键型固定相 硅-碳键型固定相

1、硅-氧-碳键型固定相 制备方法之一： 高压、过量醇、280度条件下与硅胶的硅羟基发生反应。 制备方法之二： 亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，再与过量醇进行醇解反应。 缺点：容易被水解

2、硅-氮-碳键型固定相 制备方法： 先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅胶反应。 对有机溶剂和pH=3-8的水介质稳定。

3、硅-氧-硅-碳键型固定相 制备方法： 硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅氧烷进行硅烷化反应 。 对有机溶剂和pH=2-8

4、硅-碳键型固定相 制备方法： 氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应。 稳定性优于硅-氧-碳键型固定相，但生成的产物覆盖度较低。

键合固定相的性质 1、表面覆盖度 完全水解的硅胶表面有8umol/m2硅羟基，由于位阻的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应。 好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来，利用掩蔽试剂与参与硅羟基反应，以消除其不良影响。 表面覆盖度越高，色谱保留越强。

2、键合相链长的影响 对于反相色谱固定相 键合相链长越长保留越强 对于正相色谱固定相 链长的影响不明显。 3、键合固定相基质性质的影响 基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、覆盖度等，都会对键合相有一定的影响。

高效液相色谱的色谱柱和流动相

色谱柱 HPLC柱填料 1、全多孔球形硅胶填料最为普遍 硅胶基质分为微孔(小于2nm)，中孔(2-50nm)， 大孔(大于50nm)硅胶，多用中孔和大孔硅 胶填料 2、其它金属氧化物基质填料 TiO2、Zr O2、高分子聚合物等基质的填料， 能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。

硅胶色谱柱填料的优势 硅胶有良好的机械强度 硅胶的孔结构和比表面积容易控制 硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性 硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰

硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应 碱性分析物严重拖尾，分离度低。 加入碱性流动相 添加剂抑制

反相色谱柱填料保留性能随温度的变化 lnk’与1/T在一定温度范围内呈线性关系

提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能 提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料 对硅胶进行充分封端（尾） 利用空间位阻掩蔽残余硅羟基 键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、酰胺基） 双齿键合相

高效液相色谱的流动相 常用反相色谱流动相：甲醇-水、乙腈-水 常用正相色谱流动相：正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇、正己烷-四氢呋喃 常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化钠 需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的吸收强弱，溶剂紫外截止波长见表9-4。

高效液相色谱方法的选择 反相色谱可以分析多数样品。 极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留很弱，难以有效分离，可以用正相色谱（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂-水流动相分离。 弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离。 分析离子，首选离子色谱。 生物分子的分离模式有反相、离子交换、体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式。

色谱条件的影响 色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越小分离度越高。 柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离度越大，但柱压越高（5μm到3μm柱效提高30%柱压却升高1倍）。 流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留减弱。 流速越高，保留时间越短，但柱压液越高。 柱温越高，保留时间越短，分离度有所降低。 在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱峰形时，可以进行梯度洗脱。

40度 169bar 温度的影响 90度 94bar

填料粒径的影响 SB-C8 4.6X75mm 3.5um 流通池: 5mm, 2.5uL 20~60%B (10min.) 2mL/min.

5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm 填料粒径的影响 3.5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm

填料种类的影响 -CN柱 -苯基柱 C8柱

液相色谱仪器的维护

液相色谱仪器的维护和维修 流动相需要用0.45μm的微孔滤膜进行过滤

微孔滤膜 滤膜种类分为过水相和过有机相两种

过滤有机相流动相用有机（聚四氟乙烯）滤膜。 过滤水或盐溶液作为流动相用水相滤膜。 盐溶液作为流动相时，需要先将盐溶解后再进行过滤，不能先过滤完水再溶解盐，防止盐中的固体不溶物堵塞流路。 注意：用于过滤无机流动相的滤膜溶于有机溶剂。

样品需要用0.22μm的微孔滤膜进行过滤

样品需要用0.22μm的微孔滤膜进行过滤 针式样品过滤器

流动相中的固体颗粒和密封圈碎屑会堵塞过滤白头，导致泵压过高，需要及时更换。

安捷伦液相色谱仪更换过滤白头

密封圈老化、磨碎，导致漏液

检测器的维护一 氘灯（寿命2000h左右，价格5000-6000元） 不宜频繁开关 开+关=4小时 需要用时才开，不使用时最好关闭 冲柱（平衡或冲洗）时可以不接检测器 一是节省灯的使用，二是防止污染检测器 多数仪器的检测器电源开关在开机时就已 打开，但灯的开关并没有开。

检测器的维护二 不用时充满有机流动相，如甲醇，乙腈等。 长时间未用在开始使用时检测器内可能会 有气泡，现象是检测信号呈锯齿状剧烈大 幅度波动，解决方法是快速堵住和放开检 测器的出液口，堵住时使其内部压力瞬间 增大放开后气泡会被冲出。 检测器（连有进出液两管）被堵，先检查 是否是进液管被堵（多数情况下它被堵）， 用小流速倒冲，出液管连接泵。

色谱柱的维护 色谱柱的保存参考购买色谱柱的说明书，一 般反相色谱柱（C18，C8等）用色谱纯甲醇 或乙腈充满后用堵头密封两头冰箱内保存。 色谱柱在开始使用时（或使用完毕时），用 洗脱能力强的流动相冲洗，除去上次使用时 （或本次使用时）残留在固定相上的样品污 染物等。 色谱柱冲洗过程中最好不接检测器，防止污 染了检测器。 色谱柱使用多次后（出现柱压高、柱效低等） 参考说明书冲洗再生。

色谱柱的正确连接

尽量减小缝隙，以减小死体积，减小色谱峰的展宽

常见商品反相色谱键合固定相 键合相稳定性取决于键合技术

流动相中有机组分 含量高时 流动相中有机组分 含量低时

传统的键合和封端（封尾） 固定相键合 二甲基硅烷 封端 三甲基氯硅烷

流动相pH低于2的环境中 传统的键合相分子容易水解而流失，造成色谱柱损伤，具体表现为保留减弱和残余硅羟基效应。

侧链位阻基团大的键合相分子 可以提高酸性条件下的稳定性

无封端

双封端

三封端

双齿 双封端

如何查阅色谱柱说明书 主要依据色谱柱及填料参数

色谱柱参数 基质类型 粒径大小 孔径大小 碳含量高低 封尾类型 色谱柱内径 色谱柱长度

超高效液相色谱（UPLC） UPLC和快速液相色谱

仪器方面代表性的是2004年Waters公司推出Aquity 超高效液相色谱(UPLC)，Agilent公司 从2006年相继推出Agilent 1200、1260、1290具有更高耐压限和灵活性的高分离度快速液相色谱系统（RRLC）。 色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同品牌的亚2μm（1.7μm）的色谱柱，及性能和工作范围各不相同的超高效液相色谱产品。

使用亚2微米粒径的色谱柱，用Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱（RRLC）系统进行快速和超快速分析

UPLC 超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography\ UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高效液相色谱是一个新兴的领域，作为世界第一个商品化UPLC产品的Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱系统在1996年问世，之后像安捷伦、岛津等公司也陆续开始生产超高效色谱仪。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。

Agilent 1290 液相色谱系统

UPLC的原理与HPLC相同，所改变的地方主 要有以下几点： 小颗粒、高性能微粒固定相的出现。HPLC色 谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的 粒径是5um，而UPLC的色谱柱，会达到3.5um， 甚至1.7um，具有更高柱效，更加利于物质分 离。 超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径 减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大。 故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输 液泵。

高速采样速度的灵敏检测器。 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。 UPLC比HPLC更为优越，主要表现为更高效的分离效率，即分析时间更短和分离度更大。

制备色谱

制备色谱是能够获得一定量（从几毫克到千 克甚至吨级）纯品的色谱分离方法。 制备色谱在医药工业（如外消旋体药物分子 的分离），生化技术（生物制品的纯化和植 物化学组分的纯化），精细化学品的生产方 面已成为越来越重要的制备分离手段。很多 高纯标样只能用制备色谱获得。 为了满足生物、中药等复杂体系分离纯化的 任务，制备色谱越发发挥出其作用。

制备型液相色谱技术可以简单的认为是分析型液相色谱技术的放大，一是输液泵有高的流量，二是所用的色谱柱有大的直径和柱填料有大的粒径，三是大的进样量，四是可以获得纯品。 分析型色谱注重的是分离度和分离速度，而制备色谱以获得纯品为唯一目的，在牺牲分离度和分析速度的前提下获得纯品。

制备型与分析型液相色谱的异同 分析色谱目的分析样品，制备色谱以获得纯品为目的 分析型色谱进样量小够检即可，制备色谱进样量尽可 能大。 分析色谱柱内径1-5mm，制备色谱柱1-10cm甚至更大 分析柱填料<5μm，制备柱填料>7μm。 分析色谱流速<5mL/min，制备色谱流速> 10mL/min 分析色谱检测器可以破坏样品（如电化学检测器）， 制备色谱检测器不能对样品造成破坏。 分析色谱流动相不需要易挥发，制备色谱流动相必须 具有挥发性，才利于蒸干获得样品组分的纯品。 表14-2

制备色谱根据制备量的高低分为半制备、制备 和工业制备三大类，所用色谱柱规格也是越来 越大，制备色谱柱价格昂贵，从几千到几万甚 至几十万。 经典的制备色谱多用大粒径的硅胶填装玻璃柱 作为制备色谱柱，用正己烷-二氯甲烷等正相色 谱流动相作为淋洗液制备分离纯化样品组分， 方法成本较低，但是效率低。 自动化的制备色谱仪连接高分离能力的制备色 谱柱，能够进行快速高效的自动化制备。

制备色谱分离方法的建立 建立制备型液相色谱的方法时要从分析型液 相色谱的方法开始，一般制备色谱柱相应配 备一根分析色谱柱，在分析色谱柱上先进行 色谱分离条件的实验，调节色谱条件（主要 是流动相组成、流速）获得满意的分离度， 分离度越大越利于制备分离，再以该条件为 基础，在制备色谱柱上进行实验，最终确定 制备色谱条件，进行大量的制备纯化。可以 先初步制备分离，再进行二次制备分离，以 获得纯品。

国内色谱产业的发展任重而道远