显微镜技术

目录 相关理论知识 学习内容 目的要求及原理 试剂和器材 显微镜使用方法和注意事项

相关理论知识 显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。 显微镜的历史：最早的显微镜是荷兰的眼镜商詹森（Z.Jansen1588-1628）于1604年制造。半个多世纪后，英国物理学家胡克（R.Hooke1663-1703）制造了第一台具有科学价值的显微镜，他首次观察到木栓的显微图象，发现了细胞。真正观察到活细胞的是荷兰科学家列文虎克（Antonie Van Leeuwenhoek1632-1723），他用自制的显微镜观察到池塘中的原生动物、细菌等。1931年，恩斯特·鲁斯卡通过研制电子显微镜，使生物学发生了一场革命。这使得科学家能观察到像百万分之一毫米那样小的物体。1986年他被授予诺贝尔奖。

一、显微镜的分类 1、光学显微镜 利用光学原理，把人眼所不能放大的微小物体放大成像的仪器 2.电子显微镜 （1）可见光显微镜 利用光谱的可见光部分（390-760nm）成像的显微镜 （2）不可见光显微镜 分为紫外光显微镜（390nm以下的紫外光）、红外光显微镜（760nm以上的红外光）和X射线显微镜等 2.电子显微镜 电子显微镜简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。 Content Layouts

可见光显微镜分类 1 根据显微镜的照明技术分为明视野显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜等 2 根据显微镜的成像技术分为相差显微镜、干涉显微镜、微分干涉反差显微镜和偏光显微镜等 3 根据显微镜的构造可以分为倒置显微镜、实体显微镜和比较显微镜等 4 近年来又制造出激光扫描显微镜等

体视显微镜 荧光倒置显微镜

倒置显微镜 生物显微镜 生物显微镜 生物显微镜

二、明视野显微镜 明视野显微镜是最通用的光学显微镜，以透射光（日光或人工光源）照明，标本中的各点根据光吸收的不同在明亮的背景中成像，称为明视野显微镜。人的眼睛对光波的颜色（波长）和光波的强度（振幅）能够感觉，所以，经过染色的各种生物样品是明视野显微镜的主要观察对象。 显微镜的构造与原理：光学系统和机械系统

显微镜的光学系统 目镜 物镜 聚光器及 集光器 光源 虑光器

显微镜的光学系统 （1）目镜：一般由两块或两块以上的平凸透镜组合而成。上面与眼接触的叫接目透镜，下面的叫视野透镜。两者之间或视野透镜下面有一个金属圆环叫光阑。在光阑上可以安装目镜测微尺，有时可将毛发粘在光阑上做成指针。

目镜的放大倍数 每台显微镜装有不同放大倍数的目镜，常以5X、10X、15X等字样标明 目镜的放大倍数（M）可用下式计算： M=250mm（明视距离）/fmm（目镜焦距），其中明视距离指从眼睛晶状体到目镜所放大的虚象之间的距离，一般为250mm。 显微镜的分辨力和镜像亮度有关系，而镜像亮度又与目镜放大倍数相关，即目镜放大倍数越高，镜像亮度越低。所以要达到相同的放大倍数如200倍，可采用10x的目镜与20x的物镜配合，也可采用20x的目镜和10x的物镜配合，但是提高分辨力最好选择前者。

（2）物镜： 物镜的放大倍数：5x至20x为低倍镜，40x至80x为高倍镜，90x至100x为油镜。 物镜的放大倍数（W）：W=160mm（光学筒长）/fmm（物镜焦距），光学筒长是指物镜上、下焦点平面之间的距离，一般的为100mm，也有的长170mm。 物镜的数值孔径，又称镜口率，常用NxA或A表示。数值孔径越大吸光量越多，分辨力越高。NxA=nxsina/2（n是指物镜与标本之间介质的折射率；a指镜口角。

马铃薯淀粉颗粒4倍镜下观察图片 马铃薯淀粉颗粒4倍镜下观察图片

马铃薯淀粉颗粒10倍镜下观察图片

马铃薯淀粉颗粒40倍镜下观察图片

（3）聚光器及集光器 聚光器是由聚光镜、孔径光阑、滤光镜等组成。 用途：将光线集合成束，增加照明度，提高物镜分辨力。 集光器是由集光镜和视场光阑组成。 （4）光源 显微镜的照明光源有天然光源和人工光源两种。天然光源，即利用太阳光，最好是白云反射出来的光，一般不用直射光，必要的时候要加滤光片或毛玻璃，以免影响观察效果和损坏眼睛。人工光源，如显微镜灯，日光灯，台灯等。要求是光源强且稳定，最好强度能调节；发光的颜色要适宜，最好能近似天然白光；光源发热不能过多，尤其是活体观察要防止高温造成标本死亡，所以一般要放滤光片。

（5）滤光器 用显微镜观察标本或进行摄影时，往往要选择某一波段的光线，而排除不需要的光线；或者由于光线太强需要减弱；要达到这些目的就要在光源和聚光器之间安置适宜的滤光器。滤光器的种类有两种：滤光片和液体滤光器。最简单常用的是滤光片。滤光片根据制造方法的不同可分为有色玻璃滤光片、中性滤光片和干涉滤光片

显微镜的机械装置 镜座 镜臂 机械装置 载物台 镜筒 物镜转换器 调焦装置

显微镜的机械装置 （1）镜座：又称镜脚是显微镜的基座，用以支持整个镜体的稳定。有的显微镜在镜座内有照明光源或反光镜。 （2）镜臂：支持镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。 （3）载物台：又称镜台或标本台，附着于镜臂下端上部的镜台附着器。台面与显微镜光轴垂直，它是支持被检物体的平面。台中央有一个通光孔。台上有标本夹，有的装有标本移动器。载物台可分为移动式和固定式。

（4）镜筒：金属制的圆筒，附着于镜臂上部，其上端放置目镜，下端连接物镜转换器。在设计上目镜、镜筒和物镜的中心必须必须在同一条直线上。安装目镜的镜筒有单筒和双筒两种，双筒的两者之间距离可以调节，以适应人的眼距。双筒之中有一个目镜镜筒装有屈光度调节器，便于两眼视力不同的观察者。 （5）物镜转换器：固着于镜筒的下端，可自由旋转，更换物镜。当他们转到工作位置时即与光轴合轴。安装物镜时要把镜筒提高，以防止镜头碰到载物台。转换物镜要用手指捏紧转换蝶，而不要推物镜，防止破坏合轴。

（6）调焦装置：为了得到清晰的物像，必须调节物镜与标本之间的距离，使它与物镜的工作距离相等，这种操作叫做调焦。 粗调螺旋 粗调螺旋用于粗放调节物镜和标本的距离，老式显微镜粗调螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜(如Nikon显微镜)镜检时，右手向前扭动使载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本远离物镜。 微调螺旋 用粗调螺旋只能粗放地调节焦距，难于观察到清晰的物像，因而需要用微调螺旋做进一步调节。微调螺旋每转一圈镜筒仅移动0.1 mm(100μm)。新近出产的研究显微镜的粗调螺旋和微调螺旋是共轴的。

显微镜的分辨率 显微镜的分辨率是指显微镜的最小分辨距离，即显微镜将物体放大成像后，能将物体相近两点分辨清楚的极限距离，通常用D表示。它与物镜的数值孔径成反比，与光波长度成正比。公式为：D=0.16入/NxA 入为光波波长。 NxA 为物镜数值孔径。D越小，显微镜的分辨率就越高。

显微技术 生物显微技术是指在显微镜下对生命有机体的微观世界进行定性观察（辨别颜色、形状、质地）、定量描述（测量、计数、绘图）以及细微结构的解剖等技术的总称

目的要求及原理 目的：了解普通光学显微镜的构造与原理，掌握明视野显微镜的使用方法。 原理：以透射光入射，显微镜有两种照明方式：一种是临界照明，灯丝经一个聚光器后，其像呈在标本平面上，因此对标本的照明是不均匀的。另一种照明方式为柯拉（柯勒）照明，照明光路中的光学组件包括光源、集光器、视场光阑、孔径光阑、聚光器和物台。柯拉照明比临界照明优越：其一是照明均匀，其二是通过调节视场光阑的大小和位置可以控制标本平面上照明区的大小和位置。当只需要观察或测量标本的一部分时，可以关小视场光阑，减小照明区域，使标本的其它部分不受热，并减少了杂散光的干扰。

试剂和器材 1、材料：标本装片(草履虫) 2、器材：显微镜

显微镜使用方法和注意事项 1.观察前的准备 (1)显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上 (2)将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约lOcm左右，右侧可放记录本或绘图纸 (3)调节光照。对于不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入通光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。对于自带光源的显微镜，可通过调节电阻旋钮来调节光照强弱

(4)光轴中心调节。显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。使用带视场光阑的显微镜时，先将光阑缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场光阑球形多边形的物像。如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的多边形物像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。

2．低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时粗调节旋钮慢慢升起载物台(或下降镜筒)，直至物像出现，再用细调节旋钮物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的标本物像并将它移到视野中进行观察。

3．高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍物镜同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升(镜筒下降)，直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位．并移至视野中央进行观察。

4．油镜观察 油浸物镜的工作距离(指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离)很短，一般在O.2 mm以内，再加上一些光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 使用油镜按下列步骤操作： (1)先用粗调节旋钮将载物台下降(或将镜筒提升)约2cm，并将高倍镜转出。 (2)在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 (3)从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，(或镜筒下降)，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。

(4)从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光器上的虹彩光圈(带视场光阑油镜开大视场光阑)，上调聚光器至顶位，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降(或镜筒上升)，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物像，必须再从侧面观察，重复上述操作。 (5)观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液(乙醚2份，无水乙醇3份)或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2～3下即可(注意朝一个方向擦拭)。

(6)将各部分还原，转动物镜转换器，使低倍物镜与载物台通光孔相对，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净罩子将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中 。

大肠杆菌100倍油镜下观察 假丝酵母4倍镜下观察图片 蛇行棒状的马尔堡病毒电镜下观察图片

思考题 1、物镜的种类各具有何种特点？ 2、柯勒照明法及其实质。 3、显微镜的各种能力之间有何关系？

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