第七章 微生物的生长与控制

第一节 生长的定义和测定方法 （一）细菌生长的定义和测定方法 个体和群体的关系 个体生长： 个体繁殖： 群体生长： 第一节 生长的定义和测定方法 （一）细菌生长的定义和测定方法 个体和群体的关系 个体生长： 个体繁殖： 群体生长： 群体生长= 个体生长+ 个体繁殖 微生物学中的生长指群体生长

（一）生长——群体生长 生长(growth)：微生物在适宜的条件下，不断从周围环境中吸收营养物质转化为构成细胞物质的组分和结构，使个体细胞质量增加和体积增加，称为生长。 繁殖(reproduction)：细胞个体数目的增加称为繁殖。

（二）微生物的纯培养(pure culture) 纯培养——只有一种微生物生长的培养物。 将一个细胞或一群相同的细胞经过培养，繁殖得到的后代。 纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。

获得微生物纯培养物的方法 稀释涂平板法 划线法 单细胞分离法 选择培养基分离法

（三）细菌生长的测定方法 细胞数量测定法 1. 活菌计数法（稀释平板计数法） 2. 滤膜测数法 3. 总细胞计数法（显微镜直接计数法） 4. 比浊法 细胞生物量测定法 5. 重量法 6. 生理指标法：C、P、RNA等

1.活菌计数法（稀释平板计数法） 常用来测定牛奶、食品、水及其它材料中的含菌数。 有些细菌如无法在固体培养基中生长或其他原因，可用液体稀释法，借助统计学来判断其活菌数。通过查MPN(Most Probable Number)来测知样品中活菌的可能数目。

2.滤膜测数法（膜过滤培养法）

3. 显微镜直接计数法

4. 比浊法

5. 重量法 将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净，然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其干重。 一般来说，干重约为湿重的10~20%，即1mg干菌= 5~10mg湿菌= 4~5×109个菌体。

6.氮量法(生理指标法) 微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标。 如细菌含氮量约为菌体干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白质含量。其他方法测定耗氧量或其它代谢产物。

二、细菌的群体生长规律及生长曲线 细菌的生长曲线：将少量单细胞微生物纯培养菌种接种到一定体积新鲜的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定菌体的数量，以菌数的对数为纵坐标，培养时间为横坐标，所绘成的曲线称为典型生长曲线。

迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期

1. 延迟期（迟缓期） 指少量微生物接种到新鲜培养基中，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。特点： ①群体生长速度近于零 ②细胞重量增加，体积增大，但不分裂繁殖 ③细胞内RNA特别是rRNA增高，原生质嗜碱性 ④代谢活动特别是合成代谢旺盛 ⑤对外界不利条件反应敏感。

原因：合成新的代谢酶类，适应新环境。 影响延迟期长短因素：菌种、接种龄、接种量、培养基成分。

生产实践中缩短迟缓期的常用手段 (1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； (2)利用对数生长期的细胞作为种子； (3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量

2. 指数期（对数生长期） ①菌数以几何级数增加；生长速率常数最大，代时最短而且稳定； ②个体形态、化学组成、生理特性均较为一致； ③酶系活跃，代谢旺盛。 了解细菌的代时（计算公式）

影响指数期微生物代时的因素：菌种、营养成分、营养物浓度、培养温度等。 对数生长期的微生物其个体形态，化学组成和生理特性等均较一致，代时稳定，代谢旺盛，生长迅速， 是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子。

3. 稳定期 又称最高生长期，此时微生物群体中新繁殖的细胞数目与死亡的细胞数目基本上处于平衡稳定的状态。 特点：生长速率等于0；菌体产量达到最高。 稳定期后期产生芽孢

稳定期到来的原因 ①营养物尤其是生长限制因子的耗尽； ②营养物的比例失调； ③有害代谢产物的累积； ④pH、氧化还原电位等物化条件越来越不适宜等。

4. 衰亡期 特点：细胞生活力衰退，死亡率增加，细菌总数急剧下降。细胞出现多形态；有的微生物出现自溶现象；有的会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；芽孢杆菌在这一时期会产生芽孢；？等等。 原因：外界环境对继续生长越来越不利，引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。

三、二次生长、同步生长和连续培养 （一）二次生长 （二）同步生长 （三）连续培养

微生物的高密度培养 （high cell-density culture, HCDC) 高密度培养：指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养的10倍以上。 应用：基因工程菌生产多肽类药物，高密度培养时应注意：选取最佳培养基成分和含量；补料；提高溶解氧浓度；防止有害代谢产物生成。

四、真菌生长 真菌生长的表示方法 真菌液体培养时的生长形式 丝状真菌生长的三个阶段，各有什么特征

第二节 环境条件对微生物生长的影响 温度 水分和渗透压 酸碱度 氧和氧化还原电位 辐射 化学杀菌剂和抑菌剂

一、温度 微生物可在-10～95℃范围内生长。 极端下限-30℃，极端上限105～300℃ 但就具体微生物来讲，它只能在一定的温度范围内生长。 在这一定的温度范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。 在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。

1.生长温度三基点

最低生长温度：生长繁殖的温度下限。 最高生长温度：生长繁殖的上限，此条件下，细胞容易衰老死亡。与胞内酶活性有关。 最适生长温度：生长繁殖速率最快，但不一定是一切代谢活动的最适温度，不等于最适发酵温度，也不等于积累某一代谢产物的最适温度。 乳酸链球菌：25~30℃，细胞产量最高； 30 ℃ ，乳酸产量最高； 34 ℃ ，生长最快； 40 ℃ ，发酵速率最大。

致死温度：在10min内，杀死全部供试微生物的温度下限。 基质：生理盐水；浓度：每毫升108个细胞。 指导意义：①变温控制；②消毒、灭菌的标准。

温度对微生物的生长具有双重影响 ①在一定的温度范围内，随着温度的上升，代谢活动逐渐旺盛，生长速度加快； ②随着温度的上升，细胞内物质如蛋白质、酶、核酸等对温度比较敏感，逐渐变性失活。 微生物处于自己生长温度三基点之外是极为不利的。

微生物生长的温度类型 自学：嗜冷微生物、嗜温微生物、嗜热微生物是如何划分的 ？应用？ 低温对微生物的影响 高温对微生物的影响（放到第三节讲）

低温生长机制：①酶的最适温度低；②细胞膜中不饱和脂肪酸含量高 低温杀(抑)菌机制：低温下，水形成冰晶，损伤膜系统，造成细胞质泄漏，引发死亡。 菌种保藏：加保护剂（防止冰晶过大，降低细胞脱水），杜绝反复冻融。 高温生长机制：①酶、蛋白质对热稳定；②细胞膜中饱和脂酸多。

二、氧气

1. 专性好氧菌（obligate aerobe） 必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。 绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌。 2. 兼性好氧菌（facultative aerobe） 又称兼性厌氧菌，有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下长得更好；有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶 许多酵母菌和许多细菌都是兼性好氧菌。

3. 微好氧菌（microaerophilicbacteria） 只能在较低的氧分压下才能正常生长的微生物。也通过呼吸链并以氧为最终受体而产能。 4. 耐氧菌（aerotolerant anaerobe） 可在分子氧存在下进行厌氧生活，生长不需要氧，分子氧对它也无毒害。不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。一般的乳酸菌多数是耐氧菌。

5. 厌氧菌（anaerobe） 分子氧对它们有毒，即使短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死； 在固体或半固体培养基深层才能生长； 生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供； 细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。

微好氧菌 专性好氧菌 耐氧菌 专性厌氧菌 兼性厌氧菌

为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？ 氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过程中所必需的酶。 好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能合成SOD，而不会被氧毒害。 厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。

超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase；SOD ） 催化超氧化物自由基O－2和氢离子反应形成过氧化氢和分子氧的酶。EC 1.15.1.1。 SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。 SOD是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到

1969年McCord等重新发现SOD，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 全球118位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。体内的SOD活性越高，寿命就越长。

是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。 SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。 SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞， 由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！

自由基（Free Radical）是一类非常活跃的化学物质，是个有不成对（奇数）电子的原子、原子团、分子和离子。 最重要的是氧自由基，它可聚集在体表、心脏、血管、肝脏和脑细胞中。如果它沉积在血管壁上，会使血管发生纤维性病变，导致动脉管硬化，高血压，心肌梗塞；沉积在脑细胞时，会引起老年人神经官能不全，导致记忆、智力障碍以及抑郁症，甚至老年性痴呆等，是造成人类衰老和疾病的元凶。

耐热SOD是国家“十五”、“十一五”863计划重大课题项目（课题编号：2004AA214080、2007AA100604）， 由中国科学院国家重点实验室采用先进生物发酵技术，历时八年开发出来的新一代SOD酶产品（专利号：ZL200510005207.9）。

SOD学说：1971年McCord & Fridovich

三、pH pH值对微生物的生长繁殖影响很大。 从微生物界整体来看，pH值在5~9范围内，较易生长。少数pH＜2.0或＞10.0能生长

1. 微生物生长繁殖的pH值 细菌、藻类、原生动物pH范围4.0~10.0最适的pH在6.5~7.5； 放线菌的最适pH在7.0~8.0； 酵母菌在3.8~6.0； 霉菌的最适pH值在4.0~5.8。

2. pH值对微生物生长的影响 影响细胞膜的电荷，从而影响微生物对营养物质的吸收； 影响代谢过程中酶的活性，从而影响微生物的生命活动。

微生物在不同的生理阶段有不同的最适pH值 黑曲霉进行发酵： pH值在2~3时，主要产物是柠檬酸 pH值接近中性时，则产生大量草酸。

3. 微生物的生长对环境pH值的影响 微生物在生长过程中，由于代谢作用，会产生酸性或碱性的代谢物，从而改变培养基或周围环境的pH值，影响微生物生命活动的正常进行。 为避免pH值大幅度改变，添加缓冲剂或加入不溶解的碳酸盐的方法。 在中性培养基内常加入磷酸盐缓冲剂；当培养物中产生大量酸时，可在配制培养基时加入不溶性的碳酸盐。

第三节 有害微生物的控制 一、几个基本概念 ①灭菌：灭菌是指采用任何一种方法，杀死物体上的所有微生物，包括病原微生物和非病原微生物。 第三节 有害微生物的控制 一、几个基本概念 ①灭菌：灭菌是指采用任何一种方法，杀死物体上的所有微生物，包括病原微生物和非病原微生物。 ②消毒：用物理、化学或生物学等方法杀死病原微生物称为消毒。消毒是不完全的灭菌。 ③防腐：用来防止和抑制微生物生长的方法称为防腐或抑菌。

二、物理灭菌因素——高温 通常利用温度进行灭菌、消毒或防腐。 高温导致灭菌作用，低温呈现抑菌作用。 高温引起微生物死亡，主要是由于高温使微生物细胞内的蛋白质和酶类变性而失活，代谢发生故障而死亡。

1. 干热灭菌方法 （1）火焰灼烧灭菌法 利用火焰灼烧把微生物直接烧死。此法彻底可靠、灭菌迅速，但易焚毁物品， 范围：接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物尸体等。 （2）烘箱干热灭菌法 实验室常用的一种方法，即将待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至150～170 ℃维持1～2h。 范围：玻璃器皿、金属用具及其它干燥耐热物品

2. 湿热灭菌法 在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好： ①细胞内蛋白质含水量高，容易变性； ②高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。 （1）煮沸消毒法 物品放在沸水中煮沸15～20min， 微生物的营养细胞可被杀死，但不能杀死抗热性强的芽孢，要杀死芽孢可煮沸1～2h或于水中添加0.5%石炭酸或碳酸钠。 适用于饮用水、食品、餐具等小型日用品的消毒。

（2）巴氏消毒法 杀死无芽孢病原微生物，同时保持食品的营养风味 适合：牛奶、啤酒、果酒、醋、酱油 该法一般在63～65℃，处理30min 低温长时消毒法（LTH）：61～65 ℃加热30min 高温瞬时消毒法（HTST）：71～72 ℃保持15s （3）超高温瞬时法（UHT） 灭菌温度135～150℃，处理2～6s，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽孢细菌。

（4）高压蒸汽灭菌法 把待灭菌的物品放在一个可密闭的高压蒸汽灭菌锅中，一般采用121℃蒸汽压达到0.103Mpa（表压1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15～30min。 影响灭菌的因素：不同菌种、同一菌种不同菌龄、微生物数量多少、培养基成分与组成。

（5）间歇灭菌法 利用流动蒸汽进行灭菌。 具体做法：将待灭菌的物品加热至100℃，处理15～30min，杀死其中的营养体，然后冷却，再放入37℃恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。 第二天重复上述步骤，三次左右，可达到彻底灭菌的目的。 此法不需高压灭菌锅，适于在农村推广。

（二）影响加压蒸气灭菌的因素 ①菌体浓度； ②排空程度: 蒸汽（汽化热）； ③体积； ④PH值； ⑤加热散热速度。

干热、湿热空气穿透力比较

三、辐射：紫外线、电离辐射、强可见光 紫外线（ultraviolet ray;UVR ） 是电磁波谱中波长为100~400nm辐射的总称，不引起人们的视觉。260nm杀菌作用最强。 杀菌原理：紫外线对微生物的核酸产生光化学危害。相邻嘧啶分子，尤其是胸腺嘧啶的二聚作用是最普通的光化学损害。 细菌和病毒DNA中众多的胸腺嘧啶的二聚体，阻止了DNA的复制及蛋白质的合成，从而使细胞死亡。

四、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂 一般化学药剂只能杀死其中的病原微生物，所以起消毒剂的作用，非灭菌剂。 （一）消毒剂、杀菌剂 消毒剂： 能迅速杀灭病原微生物的药物，对人体也可能产生有害作用的化学药剂。 主要用于抑制或杀灭非生物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。

化学药物一般在低浓度下抑菌，高浓度下杀菌。 理想的消毒剂和防腐剂应：作用快、效力大、渗透强、易配制、价格低、毒性小、无怪味的特点。 常用的消毒防腐剂 重金属盐类、有机化合物、氧化剂、表面活性剂、染料等。 以下各种消毒剂的作用机理及常用浓度（自学）

（1）醇类 机理：脱水剂、蛋白质变性剂，脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，损害细胞而具杀菌能力。 70%～75％的乙醇杀菌效果最好，常用于皮肤及器械的消毒。 醇类物质，随着分子量的增大，杀菌力增强（戊醇＞丁醇＞丙醇＞乙醇＞甲醇）。高级醇虽杀菌力强于乙醇，由于丙醇以上的醇不易与水相混，故一般不用作消毒剂。

（2）醛类 机理：使蛋白质烷基化，改变酶或蛋白质的活性，使微生物的生长受到抑制或死亡。 常用的醛类是甲醛，37％～40％甲醛溶液称福尔马林，因有刺激性和腐蚀性，人体不宜使用 常以2％甲醛溶液浸泡器械， 10％甲醛溶液进行熏蒸以消毒厂房、无菌室或者传染病患者的家具、房屋等。

（3）酚类 机理：低浓度的酚可破坏细胞膜组分，高浓度的酚可凝固菌体蛋白。酚还能破坏结合在膜上的氧化酶与脱氢酶，引起细胞的迅速死亡。 石炭酸：0.5％可消毒皮肤，2％～5％可消毒痰、粪便与器皿，5％可喷雾消毒空气。 甲酚：酚的衍生物，杀菌效果比苯酚强，但水溶解度低，在皂液或碱性溶液中形成乳浊液。市售的消毒剂来苏尔就是甲酚与肥皂的混合液，常用3％～5％的溶液消毒皮肤、桌面及用具。

（4）表面活性剂 机理：破坏菌体细胞膜的结构，造成胞内物质泄漏、蛋白质变性、菌体死亡。 肥皂：一种阴离子表面活性剂，对肺炎链球菌或链球菌有效，但对葡萄球菌、结核分枝杆菌无效。一般认为肥皂的作用主要是机械地移去微生物，微生物附着于肥皂泡沫中被水冲洗掉。 新洁尔灭：人工合成的季铵盐阳离子表面活性剂，0.05％～0.1％新洁尔灭溶液用于皮肤、黏膜和器械消毒。

（5）染料 机理：一些碱性染料如结晶紫的阳离子，可与菌体的羧基或磷酸基作用，形成弱电离的化合物，妨碍菌体的正常代谢，抑制生长。紫药水 （6）氧化剂类 机理：作用于蛋白质的巯基，使蛋白质和酶失活，强氧化剂还可破坏蛋白质的氨基和酚羟基。 常用的氧化剂有卤素（碘酒、氯气等）、过氧化氢、高锰酸钾。

（7）重金属 高浓度的重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂，其作用最强的是Hg、Ag和Cu。 升汞：l:(500～2000)液可杀灭大多数细菌，腐蚀金属，对动物有剧毒，常用于组织分离时外表消毒和器皿消毒。 红汞：2％红汞水溶液即红药水常消毒皮肤、黏膜及小创伤，不可与碘酒共用。 银：温和的消毒剂，0.1％～l％硝酸银可消毒皮肤，l％硝酸银可防治新生儿传染性眼炎。 硫酸铜对真菌和藻类有强杀伤力，与石灰配制的波尔多液可防治某些植物病害。

（8）酸碱类 强酸与强碱具有杀菌力。 无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但腐蚀性大，实际上不宜作消毒剂。某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂。酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵产生的乳酸抑制腐败性微生物的生长，使之得以长久贮存。 强碱可用作杀菌剂，但由于它们的毒性大，其用途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。

石炭酸系数 为比较各种消毒防腐剂的相对杀菌强度，提出了石炭酸系数这一指标。 石炭酸系数：在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌为伤寒沙门氏菌。 例如，某药剂以1：300的稀释度在10分钟内杀死所有供试菌，而达到同效的石炭酸的最高稀释度为1：100，则该药剂的石炭酸系数为3。

（二）化学治疗剂 生长因子类似物 什么是生长因子类似物？ 人类第一个专门抑制细菌生长的药物——磺胺类药物 抗生素

生长因子类似物 —— 磺胺类药物 磺胺的结构与细菌的一种生长因子对氨基苯甲酸（PABA）高度相似，PABA是细菌代谢中不可缺少的重要辅酶——四氢叶酸（THFA或CoF）结构的一个组分，因此，磺胺与PABA两者发生竞争性拮抗作用，从而使细菌的生长受到抑制。 另外磺胺增效剂三甲基苄二氨嘧啶（TMP）能抑制四氢叶酸合成代谢中的二氢叶酸还原酶，这就增强了磺胺的抑制作用。

抗生素 抗生素的发现。 在食品工业上抗生素被用作防腐剂来保藏食品。 如金霉素、土霉素、四环素来保藏鲜鱼，可使保藏期延长1倍以上； 乳链球菌素用于干酪、酸乳，防止梭状芽孢杆菌的破坏； 他乐素和枯草杆菌素用以制备罐头食品，减低灭菌温度。

抗生素的作用机理 1.抑制细胞壁合成：万古霉素、杆菌肽、青霉素、氨苄青霉素、头孢菌素。 2.破坏细胞膜的功能：短杆菌酪肽、多粘菌素B 3.抑制蛋白质合成：链霉素、卡那霉素、四环素等 为30S亚基抑制剂；氯霉素、红霉素、林可霉素50S亚基抑制剂.

4.阻碍核酸的合成 抑制DNA合成：萘啶酮酸、灰黄霉素 抑制DNA复制：丝裂霉素 抑制RNA转录：放线菌素D 抑制RNA的合成：利福平、利福霉素