MICROBIOLOGY 第三章病毒和亚病毒

病毒的特点 病毒与细胞型生物相比较，有以下几方面的特点： ① 形体极其微小，必须在电子显微镜下才能观察到，一般都可通过细菌滤器； ② 没有细胞构造，其主要成分仅是核酸和蛋白质两种，故也称分子生物； ③ 每一种病毒只含有一种核酸，不是DNA就是RNA； ④ 既无产能酶系也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质组分； ⑤ 在宿主细胞协助下，通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行增殖； ⑥ 在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并可长期保持其侵染活力； ⑦ 对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感； ⑧ 有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。

第一节 病毒 第二节 亚病毒 第三节 病毒与实践 一、病毒的形态结构和化学成分 二、四类病毒及其繁殖方式 一、类病毒 二、拟病毒 三、朊病毒 第一节 病毒 一、病毒的形态结构和化学成分 二、四类病毒及其繁殖方式 第二节 亚病毒 一、类病毒 二、拟病毒 三、朊病毒 第三节 病毒与实践 一、噬菌体与发酵工业 二、昆虫病毒 三、病毒在基因工程中的应用

第一节 病毒 病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。

一、病毒的形态结构和化学成分 二、四类病毒及其繁殖方式

一、病毒的形态结构和化学成分 (一) 病毒的大小与形态 (二) 三类典型形态的病毒及其代表 (三) 病毒的核酸和蛋白

(一) 病毒的大小与形态 1 病毒的大小 病毒名称 大小或直径（纳米） 最大的病毒 虫痘病毒 450 牛痘苗病毒 300X250X100 最长的病毒 柑橘衰退病毒 2000 甜菜黄花病毒 1250X10 铜绿假单胞菌噬菌体 1300X10 最小的病毒 口蹄疫病毒 21 乙型肝炎病毒 18 苜蓿花叶病毒 16.5 玉米条纹病毒 12-8 烟草坏死病毒 16 菜豆畸矮病毒 9-11 最细的病毒 大肠杆菌的f1噬菌体 5X800 1 病毒的大小

2、病毒的形态 球状病毒 杆状病毒 砖形病毒 有包膜的球状病毒 具有球状头部的病毒 封于包含体内的昆虫病毒

3、 病毒粒子的构造 病毒粒（子）：指成熟的结构完整的和有感染性的单个病毒。基本成分为核酸和蛋白质。 衣壳：病毒的蛋白外壳 衣壳粒：构成病毒衣壳的，在电镜下可辨别的形态学蛋白亚单位，称为衣壳粒。 核衣壳：核心和衣壳合称核衣壳 包膜：有些较复杂的病毒，其核衣壳外还被一层蛋白质或糖蛋白的类脂双层膜覆盖 刺突：包膜上的附属物

乙肝病毒构造

1、 螺旋对称的代表：含ssRNA烟草花叶病毒（TMV Tobacco） (二) 三类典型形态的病毒及其代表 1、 螺旋对称的代表：含ssRNA烟草花叶病毒（TMV Tobacco）

2、二十面体对称的代表：含dsDNA的腺病毒

3、 复合对称的代表：含dsDNA的T偶数噬菌体

(三) 病毒的核酸和蛋白 1、 病毒的核酸 DNA ssDNA——线状、环状 dsDNA——线状、环状 RNA ssRNA——线状、环状 (三) 病毒的核酸和蛋白 1、 病毒的核酸 DNA ssDNA——线状、环状 dsDNA——线状、环状 RNA ssRNA——线状、环状 dsRNA——线状、环状

 病毒蛋白：是病毒的主要成分。但种类不多；蛋白含量随病毒种类不同而不同(40~96%)；     病毒蛋白的功能： A、构成病毒粒子外壳，使病毒核酸免受核酸酶及其他理化因子的破坏。B、决定病毒的感染的特异性等。     核酸：一种病毒只含有一种核酸，RNA或DNA；植物病毒大多数属RNA型，少数DNA型；细菌病毒多数属DNA型，少数属RNA型；而动物病毒有的属DNA型，有的属RNA型。此外，无论DNA还是RNA都有单链和双链之分；核酸有正链、负链之分。     病毒包含体：有些病毒在寄主细胞内形成细胞内含物，称包含体，它主要是由一些病毒亚基、完整的病毒体和寄主编码的蛋白质在受侵染的细胞中形成的聚集体。     脂类和糖类：少数有包膜的大型病毒除含有蛋白和核酸以外，还含有脂类和糖类。

2、病毒的蛋白质 病毒蛋白质 非结构蛋白 病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。 结构蛋白 构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质 壳体蛋白； 包膜蛋白； 存在于毒粒中的酶；

Types of Viral Genomes

（四） 病毒的群体形态 包涵体：在某些感染病毒的宿主细胞内，出现光学显微镜可见的大小、形态和数量不等的小体，称为包涵体。是寄主细胞经病毒感染后形成的蛋白质晶体，内含零到几个病毒粒子。可分为颗粒体包涵体和多角体包涵体，多角体包涵体又可分为核型多角体包涵体和质型多角体包涵体。 噬菌斑：是由噬菌体在菌苔上形成的“负菌落”。是由于噬菌体侵蚀裂解菌苔上的细菌细胞而逐步形成的噬菌体群体 空斑：由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑 枯斑：由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑

Plaques on animal cell culture

二、四类病毒及其繁殖方式 (一) 原核生物的病毒——噬菌体 (二) 植物病毒 (三) 人类和脊椎动物病毒 (四) 昆虫病毒

病毒增殖的特点： 严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖 原料； 能量； 生物合成场所； 有繁殖性的病毒基因组 毒粒 宿主细胞 具有感染性的毒粒消失 毒粒 宿主细胞 病毒基因组复制、表达 病毒核酸和蛋白质 释放至细胞外 装配形成具有感染性的毒粒

(一) 原核生物的病毒——噬菌体 形态及核酸类型 代表——大肠杆菌T偶数噬菌体

1. 噬菌体的繁殖 烈性噬菌体 感染细菌后凡在短时间内完成增殖、成熟和裂解的噬菌体为烈性噬菌体。 烈性噬菌体进入细菌细胞后马上大量复制，子代噬菌体以裂解的形式释放。 裂解性周期 烈性噬菌体所经历的繁殖过程。包括吸附、侵入、增殖、装配、裂解五个过程。

Virus multiplication

(1) 吸附 感染复数：每一敏感细菌所能吸附的相应噬菌体的数量。 吸附作用受许多内外因素的影响： (1) 吸附 感染复数：每一敏感细菌所能吸附的相应噬菌体的数量。 吸附作用受许多内外因素的影响： ①. 噬菌体的数量：由于每一宿主细胞表面的特异受体有限，因此所能吸附噬菌体的数目也有一定限量。 ②. 阳离子：Ca2+、Mg2+和Ba2+等阳离子对吸附有促进作用；Al3+、Fe3+和Cr3+等阳离子则可引起失活。 ③. 辅助因子：色氨酸、生物素可促进吸附作用。 ④. pH值：在中性时有利于吸附，在<5和>10时不易吸附。 ⑤. 温度：在生长最适温度范围内最有利于吸附。

(2) 侵入 有尾噬菌体的侵入： 以注射方式将噬菌体核酸注入细胞 如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多 尾钉固着 尾鞘收缩 尾管穿入 DNA注入 如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多 小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现 象称为自外裂解（lysis from without）。

动物病毒的侵入：以3种方式侵入

病毒复制所需要的病毒特异性酶蛋白及蛋白质外壳的合成 (3) 增殖 病毒生物合成的第一步 是病毒mRNA的合成 病毒复制所需要的病毒特异性酶蛋白及蛋白质外壳的合成 （5种核酸，6条途径）

病毒基因组的表达与复制存在着强烈的时序性 病毒基因组进入胞内 宿主细胞的代谢发生改变 病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。 病毒基因组的表达与复制存在着强烈的时序性

(4) 装配 新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒的装配，亦称成熟（maturation）或形态发生（morphogenesis）。

T4噬菌体的装配是一个极 为复杂的自我装配的过程

释放（裂解） 主要有两种方式 成熟的子代病毒颗粒然后依一定途径释放到细胞外 第一种是当宿主细胞内大量子代噬菌体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酸酶和水解细胞壁的溶菌酶的作用，从细胞内部促进了细胞的裂解，从而实现了噬菌体的释放； 第二种是噬菌体成熟后并不破坏细胞壁，而是一个个的噬菌体DNA外出穿过细胞膜时才与衣壳蛋白结合，然后穿出细胞，这种情况下，宿主细胞仍可继续生存。

(5) 释放（裂解） 自外裂解：大量噬菌体吸附在同一宿主细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因而导致细胞裂解。 (5) 释放（裂解） 自外裂解：大量噬菌体吸附在同一宿主细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因而导致细胞裂解。 裂解量：每个感染了噬菌体的细菌细胞平均释放的子代噬菌体颗粒的数目。 噬菌体的相互排斥作用：如果有两种或两种以上不同的噬菌体同时侵入一个宿主细胞，最后只有一种噬菌体得以增殖，且不影响其释放的子代噬菌体数量，称为噬菌体的相互排斥作用。

2. 噬菌体效价的测定 双层平板法 噬菌体效价：表示每ML试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。常用双层平板法测定噬菌体的效价。 上层平板 上层培养基（1%琼脂培养基3ml） 宿主菌悬液 敏感噬菌体

Plaque assay

2. 噬菌体效价的测定 使用双层平板法的优点 ①. 加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补； ②. 所形成全部噬菌斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象； ③. 因上层培养基中琼脂较稀，故形成噬菌斑较大，更利于计数。

3. 一步生长曲线 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 一步生长曲线的绘制： 用噬菌体的稀释液去感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞所吸附的噬菌体至多只有一个，经数分钟后，在混合液中加入适量的相应抗血清，借以中和尚未吸附的噬菌体。然后用保温的培养液稀释此混合液，同时终止抗血清的作用，随即置于适宜的温度下培养。其间每隔数分钟取样，连续测定其效价，再把结果绘制成图即可。

一步生长曲线分三个时期： (1) 潜伏期 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子装配前的一段时间。 可分两个时期 隐晦期 在潜伏期前期人为地裂解宿主细胞后，此裂解液仍无侵染性的一段时间 胞内积累期 在潜伏期后期人为裂解宿主细胞后，其裂解液已呈现侵染性的一段时间

(2) 裂解期 (3) 平稳期 紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。 指感染后的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点的时期。

4. 溶源性 温和噬菌体：进入细菌细胞后其核酸就整合到细菌的核酸中，即并不马上复制而使细胞裂解。 前噬菌体：以核酸的形式整合在寄主细胞染色体上的温和噬菌体称为前噬菌体。

4. 溶源性 温和噬菌体的存在形式 游离态 整合态 营养态 指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子 指已整合到宿主基因组上的前噬菌体。 指前噬菌体经理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态。

4. 溶源性 细菌的溶源转变 当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性以外的新遗传性状的现象，称为溶源转变。 溶源菌 含前噬菌体的细菌。

(二) 植物病毒 多为ssRNA病毒 感染症状 因叶绿素被破坏或不能合成而使叶片发生花叶、黄化或红化 植株发生矮化、丛枝或畸形 (二) 植物病毒 多为ssRNA病毒 感染症状 因叶绿素被破坏或不能合成而使叶片发生花叶、黄化或红化 植株发生矮化、丛枝或畸形 形成枯斑或坏死

The many faces of viruses: plant viruses

(三) 人类和脊椎动物病毒 可分为dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA病毒 艾滋病病毒（HIV） (三) 人类和脊椎动物病毒 可分为dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA病毒 艾滋病病毒（HIV） 属逆转病毒，含有反转录酶，能以病毒的ssRNA为模板转录出dsDNA并将其整合到宿主的核基因组上的病毒

艾滋病的病原体：人类免疫缺陷病毒的构造

(四) 昆虫病毒 核型多角体病毒 质型多角体病毒 颗粒体病毒 无包涵体病毒

昆虫病毒基本分三类: (1) 病毒核衣壳颗粒为游离的，没有囊膜包被，也没有结晶状蛋白质包被的； (2) 核衣壳外有囊膜包被的； (3) 核衣壳外面有很多蛋 白质晶体包被，形成多角形的 包涵体，呈四面、长方、六面 和十二面等，所以称为多角体 病毒。 细胞中的昆虫多角体病毒

第二节 亚病毒 凡在核酸和蛋白质两种成分中，只含其中之一的分子病原体，称为亚病毒。

一、类病毒 是一类只含RNA一种成分、专性寄生在活细胞内的分子病原体。为裸露的环状ssRNA，通常由246~375个核苷酸分子组成。 由于它们具有感染作用，类似于病毒，故称为类病毒（viroid）。 类病毒不能像病毒那样感染细胞，只有当植物细胞受到损伤，失去了膜屏障，它们才能在供体植株与受体植株间传染。

最早发现的类病毒 发现类病毒对生命科学研究的意义 马铃薯纺锤形块茎病类病毒，为裸露的闭合环状ssRNA，相对分子质量为1.2×105，整个环由两个互补的半体组成，其一含179个核苷酸，另一含180个核苷酸。 发现类病毒对生命科学研究的意义 ① 为探索生命起源提供一个新的低层次的好对象； ② 为研究生物大分子提供一个绝好的材料； ③ 为揭开人类和动、植物的各种传染性疑难杂症的病因带来一个新的视角； ④ 为哲学家对生命本质问题的认识提供一个新的例证。

二、拟病毒 是指一类包裹在真病毒粒中的有缺陷的类病毒。一般仅有裸露的RNA或DNA所组成。目前发现的主要为RNA。 拟病毒首次是在绒毛烟斑驳病毒中分离到。该病毒是一种直径为30nm的二十面体病毒，在其核心中除含有大分子线状ssRNA（RNA-1，属病毒）外，还含有环状ssRNA（RNA-2）及其线状形式（RNA-3），后两者即为拟病毒。实验证明，只有当RNA-1与RNA-2或RNA-3合在一起时才能感染宿主。

三、朊病毒 定义： 是一类不含核酸的传染性蛋白质分子，因能引起宿主体内现成的同类蛋白质分子发生与其相似的构象变化，从而可使宿主致病。 特点： ① 呈淀粉样颗粒状 ② 无免疫原性 ③ 无核酸成分 ④ 由宿主细胞内的核酸编码 ⑤ 抗逆性强，能耐杀菌剂和高温

朊病毒——羊瘙痒病 1982年S. B. Prusiner以叙利亚仓鼠为实验材料，发现羊瘙痒病（scrapie）的病原体是一种蛋白质，不含核酸，命名为prion，意即PROteinnaceous Infection ONly，译为蛋白质感染因子或朊病毒，Prusiner因此项发现更新了医学感染的概念，获1997年的诺贝尔生理与医学奖。

朊病毒——疯牛病 疯牛病，即牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy，BSE）也属于此类疾病，发现于1986年，是由于牛被喂以由死羊骨粉制造的饲料而被感染，病牛脑内灰质及神经元都有典型的海绵状退化，出现淀粉样（amyloid）蛋白沉淀，与羊瘙痒病相似。同类型的prion也会使鹿、貂及猴子患病，人类的库鲁病（Kuru，新几内亚震颤病）和克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）为类似的疾病。

第三节 病毒与实践 一、噬菌体与发酵工业 二、昆虫病毒 三、病毒在基因工程中的应用

一、噬菌体与发酵工业 发酵工业中预防噬菌体污染的常用措施 ① 不使用可疑菌种； ② 严格保持环境卫生； ③ 决不任意丢弃和排放活菌液； ④ 掌握好氧发酵的通气质量； ⑤ 加强管道及发酵罐的灭菌； ⑥ 不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种； ⑦ 严格会客制度。

二、昆虫病毒 昆虫病毒用于生物防治 优点有 缺点有 ①. 致病力强，使用量少； ②. 专一性强，安全可靠； ③. 抗逆性强，作用久长； ④. 生产简便，成本低廉。 缺点有 ①. 工业化生产困难； ②. 多角体在紫外光及日光下易失活； ③. 杀虫效果见效较慢； ④. 昆虫也会产生抗病毒抗性。

三、病毒在基因工程中的应用 1. 噬菌体作为原核生物基因工程载体 2. 动物DNA病毒作为动物基因工程载体

杆状病毒表达系统 昆虫杆状病毒作为真核生物外源基因载体的优势 ① 具有在细胞核内复制的cDNA； ② 不侵染脊椎动物，对人畜具有可靠的安全性； ③ 核型多角体蛋白基因是病毒的非必要基因区，带有很强的启动子； ④ 对外源基因有很大的容量； ⑤ 有强启动子作为病毒的晚期启动子，因此任何外源基因产物都不会影响病毒的繁殖与传代； ⑥ 外源基因表达产物可用于工业化生产。