2.5 蛋白质的一级结构及测定 一、蛋白质结构概述 二、蛋白质一级结构 (一)概念 (二)测定 三、蛋白质与生物进化

一、蛋白质结构概述 蛋白质结构的主要层次 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 primary structure secondary structure 超二级结构 结构域 supersecondary structure Structure domain 三级结构 Tertiary structure 四级结构 quariernary structure

蛋白质的结构层次

二、蛋白质一级结构 (一)概念：多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置，称为蛋白质的一级结构(primary structure)。

蛋白质一级结构的生物学意义： 蛋白质的一级结构是蛋白质最基本的结构，它包含着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。

(二)蛋白质一级结构的测定：即多肽链中AA排列顺序，包括二硫键的位置。 英国的Sanger等于1953年（35岁）首先完成牛胰岛素的全部化学结构的测定。并因此获得了1958年（41岁）的诺贝尔化学奖。 1965年，我国科学家牛胰岛素的全合成。

蛋白质(pro)顺序测定基本方法路线 主要根据Sanger提出的方法。 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 测定每个肽碎片的AA顺序 两种以上方法 专一性裂解 AA组成分析(含每种AA的mol数、末端AA鉴定) 二硫键拆开 获得纯的pro样品，测定多肽链的数目(可通过末端分析确定) 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法 蛋白质(pro)顺序测定基本方法路线 主要根据Sanger提出的方法。

多肽N、C-末端氨基酸的测定 1、N-端氨基酸单元分析的原则 在N-端氨基酸残基上加上一个特定标记基团，这种标记基团有颜色、荧光、紫外吸收等性质，分离鉴定、得到N-端氨基酸的信息。

2、N-端氨基酸单元分析常用方法 N端： Sanger法（二硝基氟苯反应） DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（苯异硫氰酸酯反应）

Sanger法（二硝基氟苯反应） DNFB + Gly-Ala-Phe DNP-Gly-Ala-Phe DNP-Gly Ala Phe 105oC pH=8-9 室温 多肽或蛋白质的游离末端-NH2与DNFB反应，生成DNP多肽或DNP-蛋白质。水解多肽或蛋白质后，N末端氨基酸为黄色DNP-AA衍生物。用乙酸乙酯抽提出α-DNP-AA，通过层析技术进行分离鉴定。缺点：灵敏度低、肽键都要被水解掉!

Edman化学降解法(异硫氰酸苯酯法) 第一步、偶联反应 第二步、环化反应 少一个氨基酸残基的肽 ATZ（噻唑啉酮苯胺）

第三步、转化反应 PTC-氨基酸 （苯氨基硫甲酰氨基酸） ATZ(噻唑啉酮苯胺) 测定咪唑衍生物的R，即可知是哪种氨基酸。 PTH-氨基酸 （苯乙内酰硫尿氨基酸）

Edman化学降解法的特点 每进行一次Edman降解，除多肽N端的一个氨基酸残基脱下外，其余多肽链会保留下来。 这样就可以连续不断的测定剩余多肽链的N端AA，最终测得此多肽链的全部AA序列!

3、C-末端测定 A、肼解法(测定C端最常用的方法) ： 当蛋白质（或多肽）与无水肼在100℃反应5-10h后，除C端氨基酸外，所有氨基酸都转变成相应氨基酸的酰肼，C端氨基酸则以游离氨基酸放出。 NH2-NH2 100oC 5-10h Gly-Ala-Phe GlyNHNH2 AlaNHNH2 Phe

蛋白质(pro)顺序测定基本方法路线 主要根据Sanger提出的方法。 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法 二硫键拆开 AA组成分析(含每种AA的mol数、末端AA鉴定) 两种以上方法 专一性裂解 测定每个肽碎片的AA顺序 基本策略： AA顺序直测＋片段重叠法 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

二硫键的断裂 胰岛素 -巯基乙醇（还原法） 碘乙酸（烷化剂，保护巯基）

多肽链的部分裂解

羟胺法：能专一性的断裂-Asn-Gly-之间的肽键。但 化学法： 羟胺法：能专一性的断裂-Asn-Gly-之间的肽键。但 专一性不很强，Asn-Leu和Asn-Ala键也能 裂解。 溴化氰法：只断裂Met残基的羧基参加形成的肽键。 酶解法： 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶等

消化道内几种蛋白酶的专一性 氨肽酶 羧肽酶 羧肽酶 （Phe.Tyr.Trp） （Arg.Lys） （Phe. Trp） （脂肪族） 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 弹性蛋白酶 胰蛋白酶

片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意 所得资料： 氨基末端残基 H 羧基末端残基 S 第一套肽段: CKS PS ECVE RLA HCWT 第二套肽段: SEC WTCK VERL APS HC 借助重叠肽确定肽段次序： 末端残基 H S 第一套肽段 HCWT CKS ECVE RLA PS 第二套肽段 HC WTCK SEC VERL APS 推断全顺序 HCWTCKSEC VERLAPS

例：某八肽 完全水解后，经分析氨基酸的组成为：丙、亮、赖、苯丙、脯、丝、酪、缬。 端基分析：N-端 丙……………………亮 C-端。 胰凝乳蛋白酶催化水解：分离得到酪氨酸，一种三肽和一种四肽。 用Edman降解分别测定三肽、四肽的顺序，结果为：丙-脯-苯丙；赖-丝-缬-亮。 由上述信息得知，八肽的顺序为：

三、蛋白质一级结构与生物进化

1）蛋白质氨基酸的顺序与生物进化

例、细胞色素C的种属差异和分子进化 细胞色素C是一种含血红素辅基的单链蛋白，由124个AA残基构成，在生物氧化反应中起重要作用。

细胞色素C的分子进化树 生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44

细胞色素c分子的空间结构 不同生物来源的细胞色素 C中不变残基 35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。 不变的AA残基 14 10 6 100 1 34 32 30 29 27 18 17 67 59 52 51 48 45 41 38 87 84 82 80 70 68 91 Gly Phe Cys Arg Lys His Pro Leu Tyr Ala Asn Trp 75 Ile Thr Met 血红素 细胞色素c分子的空间结构 不变的AA残基 不同生物来源的细胞色素 C中不变残基 35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。

五、蛋白质一级结构的个体差异

蛋白质一级结构与功能