定量蛋白组学 Kita

从基因组学到蛋白质组学 ---人类迈入后基因组时代 从基因组学到蛋白质组学 ---人类迈入后基因组时代 20世纪上半叶，以遗传学为代表，以DNA双螺旋结构的提出而告捷； 20世纪下半叶，以分子生物学为代表，以“中心法则”的问世，DNA重组技术诞生而集大成； 20世纪90年代，“人类基因组计划（ human genome project， HGP）”的提出。

基因组计划的局限： 40～60%的基因编码的蛋白质的功能是未知的。 基因组研究的局限性 常规大规模基因表达检测技术，无法精确反映蛋白质的质与量，组织中mRNA的丰度与蛋白质的丰度并不完全一样。因为基因到蛋白质存在三个层次的调控；蛋白质复杂的后修饰无法从mRNA水平来判断。

蛋白质组学 最早是由Marc Wilkins在1995年提出的，源于蛋白（Protein）与基因组学（Genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

定量蛋白质组学(Quantitative Proteomics) 对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白，结合生物信息学揭示细胞生理病理功能，同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析

定量蛋白质组学技术 SILAC/15N ICAT/iTRAQ Spectral counts In vitro In vivo Peak area SILAC/15N ICAT/iTRAQ 基于液相色谱串联质谱联用的定量蛋白质组学技术主要有同位素标记和非标记两种，其中同位素标记有分为体内标记和体外标记两种策略。这些定量技术都是根据质谱上太短峰的特征来实现对太短的定量，从而间接实现对太短所对应的蛋白质的定量。

双向电泳技术 （ Two-dimensional electrophoresis ） 原理：利用蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋 白质。 第一向电泳：等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离； 第二向电泳：十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS — PAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。 科学家通常先进行二维(2D)凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质。

双向电泳流程 基于2D-PAGE的经典定量分析方法。 1、样品准备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 3、蛋白质的定性与定量分析：通过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。

缺点： 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、 极小蛋白质及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。 敏感性和精确低

常见的同位素标记技术 化学标记法： （1）ICAT法（同位素亲和标签技术，isotope- coded affinity tags） （2）iTRAQ法（ isobaric tags for relative and absolute quantitation ） 代谢标记法： （1）15N标记法 （2）细胞培养中含有稳定同位素的氨基酸标记法 （SILAC)

ICAT 试剂有三部分组成，有两种形式，称为“重”和“轻” 重型（含8个氘）轻型（不含氘）。 同位素亲和标签技术 （ICAT法，isotope-coded affinity tags） ICAT 试剂有三部分组成，有两种形式，称为“重”和“轻” 重型（含8个氘）轻型（不含氘）。 第一 亲和标签（生物素），用来分离经标记后的多肽； 第二 连接子，用来整合稳定的同位素； 第三 活性基团，用来特异结合巯基。

ICAT标记定量技术流程 两种蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标记 标记后等量混合，胰蛋白酶酶切 质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段

ICAT法的缺点 （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da） 与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻 对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性

同重标签标记的相对和绝对定量 (isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 由美国ABI公司2004年开发的技术。

iTRAQ试剂标记原理 报告部分：共有8种：质量数分别为114~121Da，最多可同时标记8组样品。 肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部分和平衡部位标记到肽段上。 平衡部分：质量数分别为31~24Da，与报告部分相互配合，保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。 ITRAQ试剂结构

iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰；在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。

iTRAQ实验流程 1：收集不同组别的样本并分别提取蛋白质； 2：蛋白质经过还原，封闭后用胰蛋白酶酶切； 4：等量混合各样本中的标记肽段； 5：MS/MS质谱检测及分析。

iTRAQ 技术优势 灵敏度高：可检测出低丰度蛋白； 分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等 适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。 高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析； 结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息； 自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

Label-free 指无标签标记的定量蛋白质组学研究，依赖于繁杂的信息分析完成定量过程，主要有两种： 信号强度法：根据一级质谱相关的肽段峰强度（Mass spectral peak intensity）、峰面积（Peak area）、液相色谱保留时间（LC retention time）等信息进行定量分析； 谱图计数法 ：根据二级质谱相关的每个蛋白鉴定到的肽段总次数（Peptide hide或Spectral counts）、所鉴定肽段的离子价位（Ion counts of identified peptides）等信息进行定量分析。

将质谱数据由谱峰形式转化为直观的类似双向凝胶的图谱，谱图上每一个点代表一个肽段，再比较不同样本相应肽段的强度，从而对肽段对应的蛋白质经行相对定量。

优点： 无标记定量技术与同位素标记定量技术相比，实验成本低，不需要购买昂贵的同位素标记试剂。 缺点： 不能将不同样品同时进行质谱分析，实验操作比较繁琐。需要更高的数据分析处理方法。

代谢标记法—15N标记法 简介： 在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。

优点： 高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。 缺点： （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。 （2）由于使用的15N培养基纯度>96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。

SILAC 即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC) 原理是在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg, 细胞在传代培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培养5-6代后，细胞的所有蛋白质将被同位素标记，等量混合标记的蛋白质后经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。

代谢标记法—SILAC 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。

SILAC相对于iCAT有着更高的精确性，而且不需要复杂的化学过程和纯化步骤保证了样品相似的实验条件。然而SILAC不能用于临床的组织和血液标本。

新的生物标记的发现将帮助我们更好地弄清疾病致病机制和预后，用于提高早期诊断的敏感性，找到治疗靶点，弄清药物治疗作用的机制。利用上述定量蛋白组学技术精确定量正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平，进而找出二者的差异，筛选得到与疾病密切相关的差异蛋白，进而确定靶分子，为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据。

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