专题2 细胞工程 动物细胞工程 ◆动物细胞培养 ◆动物体细胞核移植技术和克隆动物 ◆动物细胞融合 ◆单克隆抗体制备

其它动物细胞工程的基础 动物细胞培养 动物细胞工程常用技术 核移植 动物细胞融合 单克隆抗体技术

一、动物细胞培养的应用和概念： 2、原理：细胞增殖 1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖. 2、原理：细胞增殖

3：过程 原代培养 ①原代培养 图示 胚胎或幼龄动物器官组织 定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。 剪碎 单个细胞 取出组织 定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。 剪碎 胰蛋白酶处理 单个细胞 细胞悬液 原代培养 转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。

强调一：细胞贴壁过程 ■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 ■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、 易于贴附。

强调二：接触抑制 ■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

②传代培养 定义： 当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）

▲细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。 细胞系、细胞株（了解即可） ▲细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。 ▲细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。

3、总结：动物细胞培养过程 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 剪碎用胰蛋白酶处理 为什么用胰蛋白酶处理？ 单个细胞 加培养液稀释 配置细胞悬液 原代培养 原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制 转入培养瓶 细胞株：一般说遗传物质未改变 分瓶传代培养 传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。 10代细胞 传代培养 传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变） 40-50代细胞 继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。 细胞系：遗传物质已改变 无限传代

4.动物细胞培养的条件: 2）营养： 1）无菌无毒 的环境： 3）温度和pH： 4）气体环境： 1）无菌无毒 的环境： 对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。 2）营养： 液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。 3）温度和pH： 适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃。 适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4 4）气体环境： “95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养液的PH。

因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。 问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？ 因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。 问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？ 扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。 问题3：为什么用胰蛋白酶处理？ 动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰 蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和 细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？ 动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。 问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？ 控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。

问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？ 主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等 问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 问题8、动物细胞培养的原理： 细胞增殖。 问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？ 10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。

5.动物细胞培养技术的应用: 1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞 3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物

植物组织培养和动物细胞培养的比较 细胞的全能性 细胞增殖 固体培养基 液体培养基 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 新个体或细胞产物 比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 细胞的全能性 细胞增殖 固体培养基 培养基性质 液体培养基 培养基特有成分 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 培养结果 新个体或细胞产物 细胞或细胞产物 快速繁殖、培育无病毒植株等 获得细胞或细胞产物 培养目的

二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体. 2、原理： 动物细胞核具有全能性 胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。 动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 3、分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。

◆注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？ 4、体细胞核移植过程---示动物克隆---无性繁殖 1.）克隆羊多利培育过程： 黑面绵羊去核卵母细胞 白面绵羊乳腺细胞核 供体 受体 细胞核移植 ◆注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？ 重组细胞 电脉冲刺激 不完全一样！因为： 一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞. 二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。 早期重组胚胎 胚胎移植 代孕 受体 另一头绵羊的子宫 妊娠、出生 克隆羊多利

a b 1、写出ab所代表细胞工程名称：a表示： b表示: 核移植 胚胎移植 2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因： 黑面绵羊去核卵母细胞 白面绵羊乳腺细胞核 a 重组细胞 电脉冲刺激 早期重组胚胎 b 另一头绵羊的子宫 妊娠、出生 克隆羊多利 2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因： 体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。 3、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。 白色 多利全部的核基因都来自白面绵羊 4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为 aa

2.）核移植流程 受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养） 供体：优质高产奶牛 ◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？ ◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？ 1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。 ◆激活方法： ◆激活目的： ◆胚胎移植至代孕受体内 ◆促融方法：电刺激 妊娠、分娩

4.体细胞核移植技术的应用前景 看书P49-50页 1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 2.改良动物品种 3.治疗人类疾病，作为供体 4.更深入了解胚胎发育及衰老过程

许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。 5.体细胞核移植技术存在的问题 1、克隆技术本身还不成熟，成功率低； 2、克隆胚胎经常出现遗传发育问题； 许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。 3、克隆人的社会伦理问题；

动物细胞融合与 单克隆抗体

一、动物细胞融合 1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。 ◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。 ◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。

细胞融合是正常的生命活动 两个细胞正在融合 受精作用

动物细胞融合

2、诱导融合的因素 生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。) 化学法：聚乙二醇PEG诱导融合. 物理法：电激融合 病毒颗粒黏 附细胞表面 细胞膜被 病毒颗粒穿通 细胞膜连接 细胞融合、形成杂种细胞

3、动物细胞融合技术的应用 细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。

二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备 二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备 思考 人们获得抗体的传统方法是? 将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么? 效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。 运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ 能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？ B淋巴细胞在体外不能无限增殖。

单克隆抗体的制备—极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 米尔斯坦(英国)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。

小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞 体外培养 注射到小鼠腹腔 提取单克隆抗体 经免疫的小鼠 灭活的病毒等手段 第一次筛选 杂交瘤细胞 第二次筛选 杂交 细胞 灭活的病毒等手段 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞 经免疫的小鼠 提取 杂交瘤细胞 第一次筛选 用特定的选 择性培养基 第二次筛选 能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞 体外培养 注射到小鼠腹腔 提取单克隆抗体

4.怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点?原因？ 1.注射抗原的目的是什么? 产生相应的B淋巴细胞 2.诱导其融合的方法有哪些？ 3.融合后培养液中有几种细胞? 4.怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点?原因？ 选择培养基 既能在体外无限增殖，也能产生 特定的抗体 培养液中或小鼠腹腔中培养 从培养液或小鼠腹水中提取 具有双亲细胞的遗传物质 5.大量增殖杂交瘤细胞和获得单抗的方法?

动物特异性免疫 分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn） 细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG） 第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。） 第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。 选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。 提取单克隆抗体。 1、单抗的制备过程要点：

问题强化： 1）、本过程利用了哪些原理？ 免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？ 3）、为何要进行两次筛选？ 第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。 4）、如何进行第2次筛选？ 培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。

2、单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，可大量制备。 3、单克隆抗体的应用 1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点. 2、用于治疗疾病和运载药物： 主要用于癌症治疗。 生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）

例题1： 1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。 (1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合” 在一起，说明细胞膜 。 (2)单克隆抗体的准确定义应为 ( ) A．一类特殊抗体 B．无性繁殖系 C．单一抗体细胞的无性繁殖系产生的抗体 D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体 (3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______分裂，其遗传性状__________。 (4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了 _____________ 。 具有一定的流动性 C 有丝 不变 抗体能与抗原发生特异性结合的特点

BCD ACD [例题2] （1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时， 将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ） 将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ） A．T淋巴细胞 B．效应B淋巴细胞 C．抗体 D．记忆细胞 （2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中， 正确的是 (多选) （ ） A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台 病毒或聚乙二醇诱导 B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克 隆抗体 C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不 能无限增殖 D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高， 优越性明显 BCD ACD

例3： 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案 B 体外培养 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 足够数量的细胞群 注射到 小鼠腹腔 A C 制备单克隆抗体 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？ 4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。 1、该实验方案的目的是__________ 3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______ 5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。 抗体 B细胞 细胞融合 灭活病毒 双亲细胞 分泌抗体 无限增殖 原代 传代 50

课堂练习; 1.动物细胞工程技术的基础是：（　　　　） 　A．动物细胞融合 　B．胚胎移植 　C．动物细胞培养 　D．核移植 Ｃ

２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（　　） A．结果是相同的 B．杂种细胞的形成过程基本相同 C．操作过程中酶的作用相同 D．诱导融合的手段相同 Ｂ

３. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） ①淋巴细胞　 ②小鼠骨髓瘤细胞　 ③B淋巴细胞自身融合细胞　 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞　 ⑤杂交瘤细胞 A． ②④ B．①③⑤　　 C． ①②③④ 　 D．②③ C

再见

思考与回忆： 1、动物细胞全能性特点？ 2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？ 3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？ 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。 2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？ 不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。 3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？ 细胞增殖

核移植流程: 1、供体细胞的采集与培养 2、受体卵母细胞的采集与体外培养 3、显微操作去除卵母细胞中的核 4、将供体细胞注入去核卵母细胞 5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。 6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。 7、胚胎移植入代孕母牛体内 8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。

思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。

已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答： （1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。 （2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出 杂种细胞，并说原理。 方法： 。 原理： 培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞 加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖