3.3 动物细胞工程 3.3.1 动物细胞培养 3.3.2 动物细胞培养的基本过程 3.3.3 体外培养的动物细胞的生长类型 3.3.4动物细胞培养条件 3.3.5 动物细胞的冻存与复苏 3.3.6 动物细胞培养应用

3.3.1 动物细胞培养 动物细胞（组织）培养：从动物体内取出细胞（或组织），模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞（或组织）生存、生长并维持结构和功能。 起源于19世纪所应用的某些胚胎学技术。 奠基人:美国生物学家哈里森。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。

培养器具 培养瓶 冻存管 离心管 过滤器

几个概念 原代培养期（10代细胞以内） 传代培养期（10代细胞以后） 细胞株：（10-50代细胞） 细胞系：（50代细胞以后，细胞发生了癌变） 体外细胞生长增殖过程 4

原代培养 (primary culture) * 原代培养 (primary culture) 把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。 过程：从动物机体中取出组织  剪碎  加胰蛋白酶 细胞游离  加培养液  将细胞接种到培养瓶内  培养（1—2天换一次培养液） 细胞贴壁生长  长成单层细胞 动物组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养。这样的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要更换培养基，称为原代细胞。 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。 5

* 传代培养 (subculture) 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。 1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2、加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。 4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 6

* 细胞株： 细胞系： 从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。 大多数细胞株在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。 正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。 细胞系： 传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。 7

3.3.2 动物细胞培养的基本过程 在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的pH为7.2－7.4，此环境下胃蛋白酶（最适pH2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。 选材：多选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，因为它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。 8

* 基本过程： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 胰蛋白酶 动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。 （分解弹性纤维） 单个细胞 加培养液 细胞悬浮液 原代培养的细胞 10代细胞 遗传物质 未改变 细胞株通常是二倍体细胞，核型稳定。 细胞株 50代细胞 遗传物质 已改变 细胞系 无限传代 9

3.3.3 体外培养的动物细胞的生长类型 离体培养的动物细胞可分为三类： 贴壁依赖性 贴壁非依赖性 兼性贴壁细胞。

贴壁依赖性细胞 * 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞需有给予贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴壁因子才能在该表面上生长、增殖。这样的细胞称为贴壁细胞； 当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。 要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 粘附生长本是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。 11

接触抑制（contact inhibition） * 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的，而异倍体细胞无接触抑制现象，其寿命是无限的，如肿瘤细胞。

肺癌细胞SPC-A1（上皮样） 肝癌细胞SMMC-7721（成纤维样） 细胞形态会因条件而改变。如血清、培养基成分、气相、pH值等。 肺癌细胞SPC-A1（上皮样） 肝癌细胞SMMC-7721（成纤维样） 13

培养中的胃癌细胞MGC-803（多层） 这种细胞由于是癌细胞，具有无限生长繁殖能力，因此在贴壁生长成单层后，会进一步生长繁殖，层层叠叠。 14

兼性细胞 贴壁非依赖性细胞 体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，细胞透明度较大，边缘不是那么清晰，故也叫悬浮型细胞。 一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。 血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。 兼性细胞 悬浮培养类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易。 这种方法有多方面的优越性，易于大规模生产，便于过程的控制。但在悬浮状态下能生长的动物细胞种类有限，且不方便观察。 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。 15

3.3.4动物细胞培养条件 1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养要求高 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、环境要求高：温度和pH 36.5+0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） 保证细胞顺利的生长增殖 与多数哺乳类动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为37℃，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢将会受到影响甚至导致死亡。 细胞培养的pH最适为7.2－7.4之间，当pH低于6或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡 细胞的生长代谢自然离不开气体，容器空间中的O2及CO2足以保证细胞体内代谢活动的进行，但作为代谢产物的CO2在培养环境中还有另一个重要作用：即调节pH的作用。 10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。 营养要求：除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。 环境要求：包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。受环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。 另外，动物细胞的生长增殖所需时间长，其细胞分裂时间为12～48h。而如大肠杆菌等微生物，甚至半小时就是一个世代。 不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。 16

* 3.3.5 动物细胞的冻存与复苏 冷冻保存：将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏：以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。 在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温。 水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。 17

冷冻保存方法 最常用的方法：利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。 以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。 按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。本节提到的是常用的非玻璃化冻存方法。 玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。 18

植物细胞和动物细胞培养的比较 细胞的全能性 细胞增殖 固体培养基 液体培养基 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 植物个体或细胞 比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 细胞的全能性 细胞增殖 固体培养基 液体培养基 培养基性质 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 培养基特有成分 培养基特有成分的不同，是动物细胞培养与植物细胞培养的最大区别。 培养结果 植物个体或细胞 细胞株、细胞系 获得细胞或细胞产物 快速繁殖、培育无病毒植株等 培养目的 19

3.3.6 动物细胞培养应用 利用体外培养的动物细胞来大规模生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） 获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据

小结 贴壁细胞、接触抑制、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系、冻存、复苏 培养的动物细胞有哪些生长特性？ 动物细胞培养与植物细胞培养有何不同？ 动物细胞培养的应用？ 动物细胞融合的常用方法？

3.4 单克隆抗体 长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。 用这种方法获得的抗体，只能是混合抗体,产量低，特异性差，纯度低，反应不够灵敏。 人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。 要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。 血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。 如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？ 可以实现吗？有什么技术限制吗？ 很难离体培养B淋巴细胞。 22

3.4.1几个基本概念 什么是抗体？ 由何种细胞产生？ 主要分布在哪里？ 起何作用？ 什么是单 克隆抗体？ 抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 什么是抗体？ 由何种细胞产生？ 主要分布在哪里？ 起何作用？ 什么是单 克隆抗体？ B细胞 血清 特异性免疫作用 B细胞首先证明是在鸟类淋巴样器官法氏囊内发育成熟的，故称之为B细胞，发育成熟为浆细胞，分泌抗体，参与体液免疫，脾脏可以分泌；在骨髓内分化成熟；成熟B细胞可定居于周围淋巴组织，如淋巴结的皮质区和脾的红髓及白髓的淋巴小结内。 动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。 用单个B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体 ——单克隆抗体 23

传统方法获得的抗体是多克隆抗体(混合抗体) 抗 原 1 2 3 4 免 疫 脾 脏 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。 淋巴结 B细胞 1 2 3 4 1 2 3 4 传统抗血清 所有抗体混合 24

* 单克隆抗 体 ——化学性质单一、特异性强，只针对一种抗原决定簇的抗体。 杂合细胞 3.4.2单克隆抗体的制备过程 设计方案： 单克隆抗 体 ——化学性质单一、特异性强，只针对一种抗原决定簇的抗体。 设计方案： 一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖 杂合细胞

1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与用绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。 26

* 单克隆抗体制备过程 单克隆抗体 骨髓瘤细胞 B淋巴细胞 细胞融合、筛选 诱导其融合的方法有哪些？ 杂交瘤细胞 细胞培养 注射抗原 细胞融合、筛选 杂交瘤细胞 诱导其融合的方法有哪些？ 细胞培养 为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？ 筛选，继续培养 足够数量的、能产生特定抗体的细胞群 注射抗原进行免疫：腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射等。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。 注意，两次筛选，目的各异。 两次筛选分别有什么目的？ 注射到小鼠腹腔 体外培养 单克隆抗体

杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图

①动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 单克隆抗体制备过程 腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射等 如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。 一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔内注射抗原）、加强免疫（向动物静脉内注射抗原）三个过程 BALB/c mouse 29

小 白 鼠 免 疫 流 程 取出脾脏，制备细胞悬液，细胞融合 抗原混合弗氏完全佐剂进行初次免疫 加佐剂制成乳剂 BALB/c 抗原混合弗氏完全佐剂进行初次免疫 2 4 6 8 10 12 14 wk 佐剂:能使抗原缓慢释放，以便延长抗原与免疫系统接触的时间；产生高亲和力的免疫应答 至少三次相同剂量的加强免疫 试采血 效价测定 抗原 (50 mg/鼠)混合 0.5 mL弗氏完全佐剂进行初次免疫。 最后一次加强免疫 取出脾脏，制备细胞悬液，细胞融合 30

②免疫后取出脾脏 末次免疫后的3～5天期间，即可以取出脾脏分离淋巴细胞。收集脾脏细胞时应保持整个过程处于无菌状态。 31

脾脏为B细胞集中地 取出脾脏内细胞（无菌条件下操作。） 32

③PEG介导细胞融合 加入 PEG 细胞融合 2 min PEG介导的细胞融合： （1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 （2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。 （3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止PEG作用。 （4）离心，弃上清，用20％小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。 33

HAT培养基：这一步筛选，主要是筛选出杂合的瘤细胞。 ④培养、筛选 HAT培养基：这一步筛选，主要是筛选出杂合的瘤细胞。 融合后细胞悬液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。 融合后的细胞均分在96孔板中 34

融合后的细胞生长状况 刚融合完成 一个癌细胞与两个脾脏细胞 经数次分裂后 稳定的细胞群落 Juang RH (2003) 35

ELISA 筛选抗体 HAT初步筛选杂合细胞 脾脏细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 PEG 1 2 3 4 2 m 3 4 1 m 2 m 4 3 36

3.4.3 单克隆抗体的应用 医学检验试剂：主要用于特异性、敏感性要求高的的实验技术中，如传染病的快速诊断；寻找肿瘤特异性抗原及检测肿瘤相关抗原；免疫细胞抗原检测，等等（主要是利用抗原抗体的特异性反应检测特异性抗原）。 导向治疗：生物导弹或免疫导弹 抗原物质的分离和提纯：亲和层析中作为配体，可筛选特异性抗原物质 单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。 单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： 1．诊断各类病原体这是单克隆抗体应用最多的领域，已有大量的商品诊断试剂供选择。如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物感染的试剂等。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点。尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。 2．肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，但对肿瘤相关抗原（例如甲胎蛋白和癌胚抗原）的单克隆抗体早已用于临床检验。 近年来，有人利用单克隆抗体进行肿瘤分型，对制定治疗方案和判断预后也有帮助。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单克隆抗体主要用于体内诊断，结合X线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定位诊断。 3．检测淋巴细胞的表面标志用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。例如检测CD系列标志，有助于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，对多种疾病诊断具有参考意义。对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面也有指导作用。组织相容性抗原是移植免疫学的重要内容，而应用单克隆抗体对HLA进行位点检查与配型可得到更可信的结果。 4．机体微量成分的测定应用单克隆抗体和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，如诸多酶类、激素、维生素、药物等；对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和治疗均具有实际意义。 上述应用的单克隆抗体属于鼠源性，作为体外诊断试剂是满意的。鼠源单克隆抗体如作为生物制剂应用于人体，则因是异性蛋白可引起过敏反应甚至危及生命。从临床治疗及预防疾病的要求，希望制备出人源性单克隆抗体。目前虽然已有文献报道，通过人－鼠细胞杂交及人－人细胞杂交进行了一些探索，但对这些细胞株培养很不稳定，融合细胞中人的染色体往往呈选择性丢失，以致细胞株难以维持培养。因此制备人源单克隆抗体是目前急待解决的问题。 37