第五章 蛋白质分析技术 王 英 13907593478 蛋白质分析技术是用来分析蛋白质的含量、纯度、氨基酸组成和结构的技术。 第五章 蛋白质分析技术 王 英 13907593478 蛋白质分析技术是用来分析蛋白质的含量、纯度、氨基酸组成和结构的技术。 常规的蛋白分析技术包括蛋白质的分离纯化、蛋白质含量测定、蛋白质理化性质等方面。

第一节 蛋白质的分离纯化 一、蛋白质分离纯化的目的： 研究蛋白质，首先要得到高纯度并具有生物活性的蛋白质标本。 第一节 蛋白质的分离纯化 一、蛋白质分离纯化的目的： 研究蛋白质，首先要得到高纯度并具有生物活性的蛋白质标本。 蛋白质在组织细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，在生物样品中除含有目的蛋白质外，还含有其他蛋白质、多糖、脂类和核酸等混杂物质。 要研究或制备某种蛋白制剂必须进行分离纯化。

二、分离纯化的理论基础： 能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质，是因为不同蛋白质的理化和生物学性质有着极大的不同，这些差异主要是组成蛋白质的氨基酸序列和数目不同，使不同多肽链的分子量、带电状况、亲水性等存在差异，同时不同多肽链所折叠成的二级结构、三级结构和四级结构也存在差异，利用待分离的蛋白质与其他蛋白质之间存在的这些差异，即能设计出一个合理的分离方案。

三、分离纯化的主要步骤： 根据蛋白质的种类、性质、所处体系以及分离纯化的目的不同，分离纯化的步骤也不相同，但是多数分离纯化工作中都有相类似步骤与手段，如下图所示。

四、分离纯化的操作步骤 （一）选择材料和预处理 选择材料要依据试验目的及遵循以下原则： ① 选择有效成分含量高的新鲜材料； ② 材料来源丰富易得； ③ 获取工艺简单易行； ④ 成本比较低。 目标蛋白质含量受到原料的种属、季节、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品宿主菌或细胞的培养条件的影响。

材料选定后，通常进行预处理： 将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立即使用或在冷库中保存。 制备某些在体内易被分解的活性蛋白质、酶类或蛋白激素时，必须选用新鲜材料。 （二）细胞的破碎 对于组织细胞内各种蛋白质的分离纯化都需事先将组织细胞破碎，使蛋白质充分释放出来。

不同的生物体或不同的组织，细胞破碎难易不一，使用的方法也不尽相同。 胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软，用普通的匀浆器研磨即可； 肌肉、心脏组织较韧，需预先剪碎再作匀浆； 许多微生物都有坚韧的细胞壁，需用自镕、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。 目前已建立了多种破碎细胞的方法，根据作用方式的不同可分为机械法、物理法、化学法三大类。

1、机械法 通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法称为机械法，如匀浆、研磨等。 （1）匀浆：匀浆是破碎软组织最常用的方法。其原理是利用匀浆器剪切力破坏组织和细胞，释放蛋白质进入溶液。 匀浆器有四大类，刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器及用于规模生产的高压匀浆器。

（2）高速组织捣碎： 此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 （3）研磨： 研磨是破碎单一细胞的有效方法。借助于研磨中磨料和细胞间的剪切力及碰撞作用破碎细胞。 常用的磨料为石英沙、氧化铝等。 主要用于细菌、酵母等的破碎。

2、物理法 通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法称为物理法。 （1）超声法：利用超声波作用于溶液产生的震荡冲击波使细胞裂解。 超声波破碎的效率取决于频率、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。 超声波破碎操作简便，效率高，样品损失少，适用于微生物材料。例如：用大肠杆菌制备各种酶。 破碎过程会产生大量的热应采取降温措施。

（2）反复冻融法： 把待破碎的样品冷至－15～－20℃，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物细胞及细胞内的颗粒可以破碎。 此过程易使活性蛋白失活。 （3）冷热交替法： 将材料投入90℃水中维持数分钟，立即置于冰浴，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破碎。 此法适用于从细菌或病毒中提取蛋白质。

（4）低渗裂解法： 无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解。 （5）加压破碎法： 加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀质机），达20.59～34.32（兆帕）MPa（210～350kgf／cm2）的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。

3、化学法 （1）有机溶剂：有机溶剂(苯、甲苯)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来。 丙酮可以破碎细胞膜，而且可以制成具有活性的蛋白干粉，即丙酮粉，它能长时间保存，另外它还可以脱去脂肪，便于后续的抽提。 （2）表面活性剂：表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。

（3）酶解：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法称为酶解法。利用此法处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，例如： 溶菌酶（Lysozyme）是专一破坏细菌细胞壁的酶； 蜗牛酶用于酵母细胞的破碎； 用胰酶处理猪脑制备脑安素。 用于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶（破坏植物细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。 酶解时，应注意控制温度、酸碱度、酶用量、先后次序及时间。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内的蛋白水解酶和核酸水解酶释放到溶液中，使生物大分子降解，导致天然物含量减少。 为了防止天然物被降解可加入二异丙基氟磷酸(DFP)抑制或减慢自溶作用，加入碘乙酸可以抑制活性中心需要有巯基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能抑制蛋白水解酶的活力。

（三）细胞器的分离 细胞内各种不同细胞器的密度和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是差速离心法，其过程包括组织细胞匀浆、分级离心和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

（四）分离纯化目的蛋白 1、根据蛋白质分子大小差别分离的方法： 蛋白质分子是高分子化合物，其种类繁多，分子质量差别很大，据此可设计一些分离纯化的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。 （1）透析和超滤： 半透膜具有一定的孔径，对通过的分子大小有一定的选择性。在透析过程中，大分子蛋白质不能通过半透膜而滞留在透析袋内，小分子物质可以自由进出透析袋，直到它们在透析袋内外的浓度达到平衡。透析时需反复更换透析液，使小分子物质较完全地除去。透析过程中可测定透析外液中的某种小分子的浓度，以检查透析结果。

超滤法是利用高压力或离心力，使水和其他小分子的溶质快速通过半透膜，而蛋白质则留在膜内，从而分离、浓缩了蛋白质。该法缩短了操作时间。 可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。 （2）离心分离： 依据蛋白质分子量、形态和质量的不同，它们在离心力场中表现出不同的沉降速度，使蛋白质混合物得到初步分离。

①差速离心法：逐步分级加大离心力 开始用较低的速度离心，使可溶部分和不溶部分分开。取上清液加大离心速度，使某些沉降系数大的物质沉淀，其他物质仍保留在溶液中。再次取上清液，再加大离心力，又使一些物质沉淀，如使反复多次，可将混合物中不同的物质逐级分开。但分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。 ②等密度梯度离心： 根据物质密度的大小在离心管中造成一个密度梯度环境，使分离物在离心力的作用下，各自停留在其密度相同的区域，从而达到分离的目的。常用的离心介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铂、溴化钾、碘化钠等。

3．凝胶过滤：分子筛层析 这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 凝胶颗粒是一类具有三维多孔性网状结构的物质，蛋白质混合物中因各分子大小不同而被“筛”阻，使之分离。 被分离的蛋白质分子量应在凝胶工作的范围内，选择不同分子量的凝胶可用于脱盐、分离蛋白质等。最常用的填充材料是葡聚糖凝胶（sephadex gel）。

2、根据蛋白质溶解度不同分离的方法 （ 1 ）盐析法： 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，大量的盐离子可和蛋白质离子竞争溶液中的水分子，从而降低了蛋白质分子的水合程度，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，这种现象称为盐析。 盐析时溶液pH靠近蛋白质等电点效果更好。 由于各种蛋白质亲水程度不同，故调节中性盐的浓度可使蛋白质分段沉淀。

常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。应用最多是硫酸铵，其优点是溶解度大（25℃时饱和度为4 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。应用最多是硫酸铵，其优点是溶解度大（25℃时饱和度为4.1mol／L，即767g／L），在这溶解度范围内，许多蛋白质都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5—5.5之间。 影响盐析的因素： ①温度：温度低蛋白质溶解度降低。除个别蛋白质需在 4℃外均可在室温进行操作 。 ② PH：大多数蛋白质在等电点时溶解度最低。 ③蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，被沉淀的目的蛋白质中常夹杂其他蛋白质一起沉淀（共沉淀现象），因此盐析前需加生理盐水稀释，使蛋白质含量在3％左右。

（ 2 ）等电点沉淀法： 蛋白质在等电点状态时静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有所差别，可调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，常与盐析法结合用。 （ 3 ）有机溶剂沉淀法： 某些有机溶剂（如甲醇、乙醇或丙酮等）能使蛋白质脱水，降低蛋白质的溶解度，增强蛋白质分子之间的作用力使之析出沉淀，此法分辨力比盐析高，但蛋白质易变性，需在低温下进行。不同蛋白质的沉淀所需的有机溶剂浓度不同，选用适当浓度的有机溶剂可以粗分蛋白质的组分。

（ 4 ）某些蛋白质沉淀剂的作用： 有些离子型的表面活性剂、生物碱或酸类试剂，可以通过改变蛋白质的带电性质使其沉淀下来。例如：苦味酸、钨酸、三氯醋酸等含多价离子，能中和蛋白质分子的大部分电荷，并和蛋白质形成复合物共同沉淀下来。还有一些水溶性非离子聚合物，例如：右旋糖苷硫酸钠、聚乙二醇(PEG)也能引起蛋白质的沉淀。

3、根据蛋白质带电性质分离的方法 根据蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 （ 1 ）电泳法： 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同得以分开。 值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止。

（ 2 ）离子交换层析法： 离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度的方法将吸附的蛋白质洗脱下来。 4、根据配体特异性分离的方法——亲和层忻法 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

这种方法根据某种蛋白质能与一种称为配体(1igand)的分子特异、非共价结合而被吸附在亲和层析柱上，后可通过改变缓冲液的离子强度和pH的方法，将该蛋白质洗脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱。 亲和层析具有特异性强、结合效率高、分离速度快的特点。可与超滤结合起来，将两者优点集中组成超滤亲和纯化，形成高分离效率和大规模工业化的优势，用于初分离。 配体可以是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体等。

五、样品的浓缩、干燥及保存 （一）样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于纯化而使样品变得很稀，为了保存和鉴定，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法有： 1．减压加温蒸发浓缩法： 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

2．空气流动蒸发浓缩： 空气的流动可使液体加速蒸发。如将样品溶液装入透析袋置于冷室，用电扇对准吹风，使溶剂不断蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3．冰冻法： 将待浓缩样品放在低温结成冰 （盐类及生物大分子不易结冰内而留在液相中），然后缓慢地溶解，利用溶剂与溶质熔点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。例如：蛋白质的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质的冰结晶浮于液面，蛋白质集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质的浓缩液。

4．吸收法： 通过吸收剂直接吸收除去溶液使之浓缩。所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡络酮、蔗糖和凝胶等。使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇覆盖置于4℃下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的浓缩程度。

5．超滤法： 液体在一定压力(氮气压或真空泵压)下通过超滤膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻而保留。该法适于蛋白质和酶的浓缩或脱盐，它具有成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持生物大分子的活性、回收率高等优点。 应用超滤法要注意膜的选择，不同类型和规格的膜水的流速、分子量截止值等参数均不同，必须根据实际需要来选用。 超滤装置形式、溶质成分及性质、溶液浓度等对超滤的效果有一定影响。如用超滤膜制成的纤维管超滤透析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短了10倍。

（二）干燥 生物大分子制备得到的产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是真空冷冻干燥。 在相同压力下，水蒸气压力随温度下降而下降，故在低温低压下，冰易升华。操作时先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。 此法干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

（三）贮存 生物样品的稳定与保存方法有很大的关系。 干燥制品比较稳定，在低温情况下其活性可保存数年，只要将样品置于干燥器内贮藏于0℃- 4℃冰箱即可。 液态贮藏应注意以下几点： 1．样品不能太稀，样品太稀易变性。故须浓缩到一定浓度才能封装贮藏， 2．需加防腐剂和稳定剂，常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等。酶类可加入底物和辅酶以提高其稳定性。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。 3．贮藏温度大多数在0℃，有的则要求更低，视不同物质而定。

第二节 蛋白质的含量测定 在蛋白质的分离纯化的过程中，经常需要测定蛋白质的含量。临床上诊断疾病和观察病程，也往往需要测定体液中蛋白质的含量。因此蛋白质含量的测定是蛋白质结构与功能研究的重要基础工具，在实际工作中具有重要的意义。 下面介绍蛋白质含量测定常用的方法。

一、凯氏定氮法 1883年丹麦化学家Kjeldahl建立，后经不断改良，使之在精确性、敏感性和操作的简便程度上不断改进，至今凯氏定氮法仍然是建立各个具体方法时采用的参考标淮方法。 其基本原理： 生物样品与浓硫酸一起加热消化，其中含氮化合物被分解并转化为硫酸铵；再与氢氧化钠作用使氨释出，释出的氨用硼酸吸收生成硼酸铵，再用标准硫酸滴定，求出生物样品中氮的含量。根据蛋白质平均含氮量为16％，用氮的含量乘以6.25即可算出蛋白质的含量。

凯氏定氮法的优点是适用于一切样品的测定。可用于动、植物的各种组织、器官以及食品、土壤等成分复杂的蛋白质的含量测定。尤其是样品溶液浑浊，用其他方法不能测定，采用凯氏法可以获得可靠的结果。 主要缺点是：①样品中的非蛋白氮使测定值偏高，因此测定前需除去与样品共存的非蛋白氮。②含碱性氨基酸、酰胺和小分子量氨基酸(甘氨酸、丙氨酸等)偏多的蛋白质含氮量明显高于理论含氮量，造成测定结果偏高；③操作过程繁琐，对操作者的技术熟练程度要求高，易受实验室空气中氨含量的影响。

二、双缩脲法 双缩脲比色法是目前最常用的蛋白质定量方法。 其原理是Cu2+与蛋白质的肽键络合，形成紫红色络合物，此物质可540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。此法常用于0.5g/L-10g／L蛋白质溶液的测定。 其优点在于核酸、硫酸铵等其它非蛋白质成分不干扰显色，在提纯早期阶段复杂生物体系中快速测定其中蛋白质的含量非常有用。

其缺点是特异性不强，凡分子中含两个以上的-CO-NH2键化合物，均可与碱性铜溶液作用形成紫色化合物，影响测定结果。 为提高灵敏度发展了微量双缩脲法。此法显色原理与双缩脲法相同，用310nm进行比色测定 。

三、福林酚试剂法 原理：酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸可与蛋白质分子中的酪氨酸的酚羟基作用，失去氧原子形成还原型的混合酸。在碱性环境中烯醇化的肽与铜离子络合，络合铜再与还原型的混合酸进行氧化还原反应，产生深蓝色化合物(铂蓝和钨蓝混合物)）。此蓝色的深度与蛋白质的含量成正比，故可用比色法测出蛋白质的含量，测定范围在25ug--250ug/ml内。

优点是操作简便、灵敏度高、不同蛋白质之间的差别较小，是一种可靠的、广泛的蛋白质定量方法。 缺点是反应中干扰物质多，反应速度慢，某些试剂不稳定。例如：在样品中含有酚类、柠檬酸、Tris、蔗糖等物质时，对该反应有较大的干扰作用。

四、紫外吸收法 蛋白质在紫外区有两个吸收峰。一个在280nm处，是由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸苯环上的共扼双键引起的。在大部分蛋白质中这些氨基酸含量差别不大，故可以用溶液在280nm处的吸光度推算出蛋白质的含量。此法可对0.1mg---1.0mg/mL范围的蛋白质溶液定量测定。 蛋白质制剂中常混杂有核酸,后者在280nm处也有很强的吸光度,但在260nm处更强，而蛋白质的情况正好相反，因此可利用Lowry-Kalckar公式计算含量： 蛋白质浓度（mg/mL）= 1.45A280 — 0.74A260。

另一个吸收峰在200~225nm处，主要取决于蛋白质溶液的肽键，蛋白质在此处的吸光度要比280nm处强10~30倍，据此亦可测定蛋白质含量。此法可对 0.02mg --- 0.1mg/mL范围的蛋白质溶液定量测定。Waddell提出一个经验公式来计算待测蛋白含量： 蛋白质浓度（mg/mL）= 144×（A215 — A225）。

紫外吸收法测定蛋白质含量方法的优点在于简单、灵敏、快速、不消耗样品，因此广泛应用在蛋白质和酶的制备中。特别在柱层析分离中，进行紫外检测，可判断蛋白质吸附和洗脱情况。 紫外光谱吸收法的主要缺点是精确度差，紫外光谱吸收法主要用于蛋白质的快速含量检测，此时对蛋白质的定性需求高于准确定量需求。

五、染料结合法 蛋白质可与氨基黑、考马亮蓝等染料特异结合，这一性质除了可以用于蛋白质电泳区带的染色，亦可用于总蛋白质的定量。马斯亮蓝染色法突出优点是：①灵敏度高，最低可检测1ug/mL蛋白质。②测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。 六、其它方法 测定蛋白质含量的方法很多，除上述常见方法，还有电泳法、免疫化学法等。 在实际工作中要根据具体条件和要求，选择适当的测定方法。