4.6. 食品中蛋白质含量的测定 4.6.1 概述 4.6.2 凯氏定氮法测定蛋白质含量 4.6.3 蛋白质的快速测定法 4.6. 食品中蛋白质含量的测定 4.6.1 概述 4.6.2 凯氏定氮法测定蛋白质含量 4.6.3 蛋白质的快速测定法 4.6.4 氨基酸总量的测定 教学目标：掌握食品中蛋白质和氨基酸态氮测定的操作技能

4.6.1 概述 (1)蛋白质的生理功能 (2)蛋白质含量的测定意义 (3)蛋白质的组成及性质 (4)蛋白质的测定方法 (5)蛋白质系数

4.6.1 概 述 （1）蛋白质的生理功能 蛋白质是生命的物质基础 维持人体的酸碱平衡、水平衡 遗传信息的传递 4.6.1 概 述 （1）蛋白质的生理功能 蛋白质是生命的物质基础 维持人体的酸碱平衡、水平衡 遗传信息的传递 物质的代谢及运转都与蛋白质有关。

(2)蛋白质含量的测定意义 人体重要的营养物质,食品的营养指标。 合理开发利用食品资源、优化食品配方、控制生产过程 、提高和监督产品质量。

2004/4安徽阜阳劣质奶粉致大头娃娃171,13人死 头脸胖大，四肢细短，体重比出生时还轻 205个奶粉品46个不合格生产厂家的55种奶粉。分布8个省，其中蛋白质含量低于5%的有31种，最少的仅为0.37%，

(3)蛋白质的组成及性质 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大。 组成：20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合 化学元素：C、H、O 、N（P、S、Cu、Fe、I）； 官能基团：肽键、氨基酸残基、酸碱基团、芳香基团 结论：含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。

(4)蛋白质的测定方法 一类是利用蛋白质的共性，如含氮、肽键、折射率等 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性或碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。 目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，通过测总氮量来确定蛋白质含量。

(5)蛋白质系数 蛋白质系数：每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般蛋白质含氮为16%，所以1份氮素相当于6.25份蛋白质。此数值（6.25）称为蛋白质系数，用F表示。 不同的蛋白质由于氨基酸的构成比例及方式不同，含氮量不同。 不同种类的食品的蛋白质系数有所不同。

不同产品的蛋白质系数(F) 玉米、鸡蛋、青豆等：6.25 花生：5.46 大米：5.95 大豆及制品：5.71 小麦：5.70 牛乳及制品：6.38

4.6.2 凯氏定氮法 GB 5009.5-2010 以乳粉为样品进行讲解和演示 是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量的方法。 粗蛋白：新鲜食品中含氮化合物大都以蛋白质为主体，由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，所以结果为粗蛋白含量。 凯氏定氮法：常量法、微量法及自动定氮仪法等。

一、凯氏定氮法的原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

步骤：消化、蒸馏、吸收、滴定、结果处理。

（1）样品消化 浓硫酸的作用： 脱水作用—使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用—将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫 2 NH2-(CH2)2-COOH +13H2SO4→(NH4)2 SO4+6CO2+12SO2+16H2O 浓硫酸的作用： 脱水作用—使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用—将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫 酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4＋C ＝2SO2＋2H2O＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性消化液中。

硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失。 硫酸钾的作用： 提高溶液沸点而加快有机物的分解 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失。 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。

加入硫酸铜的作用 ①催化作用：加速有机物的氧化分解 C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑ 随反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有 硫酸亚铜(褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 ②消化完全的指示：蓝绿色，澄清，透明； ③蒸馏时碱性反应的指示：变深蓝色或产生黑色沉淀

（2） 蒸馏 氢氧化钠的作用：使消化液呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气。 (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3↑ + Na2SO4 + 2H2O

（3）吸收 硼酸溶液：吸收氨气，形成强碱弱酸盐 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

（4）滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定, 溶液由蓝绿色→灰红色 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

（5）结果计算 式中：W---蛋白质的质量分数，%； c---盐酸标准溶液的浓度，mol/L； V0---空白滴定消耗标准液量，mL； m---样品质量，g； 14---氮的摩尔质量，g/mol； F---蛋白质系数。

讨论： 1.蛋白质系数是如何计算出来的？蛋白质的测定 结果为什么要乘以蛋白质系数？ 2.蛋白质的测定方法有哪些？国家标准是哪一种方法？ 1.蛋白质系数是如何计算出来的？蛋白质的测定 结果为什么要乘以蛋白质系数？ 2.蛋白质的测定方法有哪些？国家标准是哪一种方法？ 3.为什么说用凯氏定氮法测出的是粗蛋白的含量？ 4.通过学习凯氏定氮法的原理，我们可知道操作分为哪几个大的步骤？ 5.实验中用到哪些试剂？作用是什么？

二、适用范围： 适用于各类食品中蛋白质含量测定 三、仪器、试剂: 500mL凯氏烧瓶、凯氏定氮装置 消化用：①浓硫酸 ②硫酸钾　③硫酸铜 蒸馏用：④40%氢氧化钠溶液 吸收用：⑤4%硼酸 滴定用：⑥HCl标准溶液 　 ⑦0.1%甲基红、溴甲酚绿混合指示剂

4.6.2.1微量凯氏定氮法操作步骤 演示乳粉的消化、微量凯氏定氮装置的安装与使用 （1）样品消化 : （1）样品消化 :   准确称取一定量的样品，小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.2g、硫酸钾6g和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒。 将凯氏烧瓶以45º斜支于电炉上。

先小火加热，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后加大火力，保持瓶内液体微沸。 至液体变蓝绿色透明后，继续加热微沸30min。 关闭电炉，取下烧瓶、冷却，转移至100mL容量瓶中，加水定容。

消耗过程中注意问题： ①加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈。 ②消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶。 ③样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫。 ④消化完全后要冷至室温才能稀释定容。 ⑤所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。

（2） 蒸馏与吸收 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。

在接受瓶中加入10mL40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。 准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗迅速加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。 指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min

蒸馏、吸收注意问题： （1）整套装置不能漏气。 （2）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。 （3）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过40℃，若超过时可置于冷水浴中使用。 （4）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性，以防氨蒸出。

（5）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。 （6）在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管。（倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放出废水。）

（3） 滴定 将接受瓶内的硼酸液用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。

(4) 结果计算

思考： 1.为什么在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和指示剂甲基橙？ 2.为什么在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管？如何洗涤？ 3.操作过程中有哪些注意事项？如何提高测定结果的准确度和精密度？

4.6.2.2 常量凯氏定氮法 步骤： ①消化：同“微量法” ②蒸馏、吸收： 与微量法有哪些 的不同？

③滴定：用0.1000mol/L盐酸标准溶液，其余同“微量法”。 ④.计算：与微量法的不同？

4.6.3 分光光度法测定蛋白质含量 （GB 5009.5-2010第二法） 原理：试样与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在PH=4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。 氨氮标准溶液（1.0g/L）：精密称取经105 ℃干燥的硫酸铵0.4720g，用水溶解并定容至100mL ,临用时用水稀释至0.1g/L

4.6.4 燃烧法测定蛋白质含量 （GB 5009.5-2010第三法） 试样在900℃—1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气流通过热导仪(TCD)进行检测。 仪器：氮/蛋白质分析仪

4.6.5 水杨酸比色法 原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸和次氯酸钠作用生成兰色化合物，在660nm处比色测定，求出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。 需用硫酸铵配制氮标准溶液，同时需做空白试验。

4.6.6 双缩脲法 双缩脲的性质：当脲被小心地加热至 150～160 ℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。 原理：蛋白质分子中肽键（—CO—NH—）与双缩脲结构相似，也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm。 特点： 操作简单快速，灵敏度低，常用于生物化学领域。

4.6.7染料结合法 原理：在特定的条件下，蛋白质可与某些染料定量的反应生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完全后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而求得样品中蛋白质的含量。 适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮料等食品。

4.6.8其他方法 凯氏自动定氮仪法 考马斯亮蓝染料比色法 福林—酚比色法

与蛋白质有关的检测项目： 非蛋白质氮含量 全氮含量 铵盐含量

作业 1.样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？ 2.消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？ 3.如何判断消化的终点？ 4.蛋白质系数是如何计算出来的？蛋白质的测定结果为什么要乘以该系数？ 5.为什么凯氏定氮法测定的蛋白质是食品中粗蛋白的含量？ 6.凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作步骤如何？加入的各种试剂起什么作用？操作过程中有哪些注意事项？ 7.蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为什么要用硫酸调成酸性？ 8.继续进行蛋白质测定的操作训练

4.6.9氨基酸的测定 双指示剂甲醛滴定法 电位滴定法 茚三酮显色法 氨基酸的分离及测定 以酱油为样品进行讲解和演示

构成蛋白质的氨基酸主要有20种，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。 4.6.9.1概述 构成蛋白质的氨基酸主要有20种，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。 为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。 因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。

氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。 氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。

电位滴定法 氨基酸态氮的测定 双指示剂甲醛滴定法

4.6.9.2 双指示剂甲醛滴定法 原理： 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。

方法特点及应用 此法简单易行、快速方便，在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。

试剂 ①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 ②0.1%百里酚酞乙醇溶液 ③0.1%中性红50%乙醇溶液 ④0.1moL/L氢氧化钠标准溶液

操作方法 ①预处理：固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃取，萃取可在50 ℃水浴中进行0.5h即可。液体样品可直接进行测定。 移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份 ②中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）：其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点，记录V1

③滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）： 另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录V2

结果计算 式中 c ----氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1----用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，mL; m----测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014----氮的毫摩尔质量，g/m mol

说明及注意事项 （1）此法适用于测定食品中游离的氨基酸的总量。 （2）特别适合浅色样品的测定，若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。 (3) 与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH时的PH为8.5~9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。

4.6.9.3 电位滴定法 边讲解边演示操作 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的电极插入被测液中，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。 仪器： 酸度计、磁力搅拌器

试剂： 酚酞乙醇指示液：1% 甲醛：36%--38% 氢氧化钠标准溶液：0.05moL/L

操作步骤 ①吸取适量的样品溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V，可计算总酸含量）。 ②加入10mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V1。

③用水代替样品做空白试验，先用0. 05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8. 2，再加入10. 0mL甲醛溶液，用0 ③用水代替样品做空白试验，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数V2

第一次滴定是除去其它游离酸，所消耗的NaOH溶液体积不用于计算氨基酸态氮，但可计算总酸含量。 在测定过程中为什么要加入中性甲醛的作用是什么？

结果计算 式中 W---氨基酸态氮含量，%; c---氢氧化钠浓度，mol/L； V1---加入甲醛后耗NaOH的量，mL； 0.014---氮的毫摩尔质量，g/mol； m--样品量，g

说明 ①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定 ②对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。 ③结果要求精密度≤10% ，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。 ④试样中有铵盐存在会使结果偏高。要得到准确结果需同时测定铵盐含量，将氨基酸态氮的结果减去铵盐的结果比较准确。

4.6.9.4 茚三酮比色法 原理：氨基酸在碱性溶液中与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，该化合物的颜色深浅与氨基酸的含量成正比。 在570nm处测吸光度，用氨基酸标准溶液绘制标准曲线。 样品溶液需澄清，通常采用活性炭脱色处理。 必要时，茚三酮使用前需纯化。

4.6.9.5 氨基酸的分离及测定 通常采用： 氨基酸自动分析仪(GB/T 5009.124-2003) 气相色谱法 液相色谱法

作业与讨论 1.双指示剂法为什么要同时准备两份样品？ 2.如何针对不同的样品进行处理？ 3.双指示剂法的适用范围及注意事项是什么？ 4.电位滴定法与双指示剂甲醛滴定法相比有何优点？ 5.氨基酸态氮测定时，加入甲醛的作用是什么？