实验 双缩脲法测定蛋白质浓度.

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1 实验 双缩脲法测定蛋白质浓度

2 实验目的 1.学习蛋白质含量测定的原理和方法 2.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法

3 蛋白质含量测定的原理和方法

4 微量凯氏定氮法 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。

5 氮的总量测定—凯氏定氮法 消 化 CO2+SO2+H2O+NH3 ↑ +浓H2SO4 N NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸 馏
H2O+Na2SO4+NH3↑ (NH4)2SO4+NaOH 吸 收 NH3+H3BO3 NH4HB4O7+H2O 我 滴 定 NH4HB4O7+HCl+H2O NH4Cl+H3BO3

6 双缩脲法 原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg 540 nm

7 Folin-酚试剂法(Lowry法) Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高（20-250g）、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。

8 紫外分光光度法 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

9 总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/mL；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/mL 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝

10  基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

11 考马斯亮蓝染色法 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高10－100μg （比Lowry法灵敏4倍）。

12 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH 2 3 NH C N SO - Na

13 蛋白质含量的测定 紫外吸收法 双缩脲法 Folin-酚法 考马斯亮蓝法 检测 波长 280 nm 540 nm 650 nm 595 nm
范围 mg 1-10 mg 25-250µg µg 繁琐 程度 简便 较简便 应用 纯度高样品 快速但不十分精确 受多种因素干扰 干扰较少 我

14 本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量

15 双缩脲法 原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg 540 nm

16 1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组）
一、操作步骤 1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组） 管号 1 2 3 4 5 6 样品 牛血清白蛋白(mg) 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0 2mg/mL牛血清白蛋白体积(mL) 0.3 1.8 3.0 － 待测液体积(mL) 3.0* （取2个不同体积） 蒸馏水(mL) 2.7 OD540 2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL，37oC反应30min。 3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。

17 二、结果处理 1. 绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2
二、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。 三、注意事项 1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.用坐标纸绘制标准曲线，注明轴名称及单位。 4.比色杯的使用