实 验 一 自动物脾细胞中提取哺乳动物细胞基因组DNA

一、实验目的及背景 高等动物、植物的基因组相当宠大，如人类细胞基因组由3×10９个碱基对组成，果蝇基因组有1.4×10８个碱基对，水稻基因组有1.4×10９个碱基对，等等。 真核细胞基因组中，约1-1.5万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。 某特定物种的基因组，包含了该物种生长、发育、繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构组成，以及表达调控的研究是至关重要的。

而研究的起点就是要获得纯度高－－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－－以便有足够量用于分析；基因组相对完整－－以便用于以后ＰＣＲ（链式酶聚合反应）分析，RFLP（限制性片段长度）分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。 基因组DNA的获得是进行基因结构和功能研究的重要步骤,基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP—restriction fragment length polymorphism)及PCR分离基因等。

二、DNA提取的几种方法 CTAB法（植物DNA提取经典方法） 酚氯仿抽提法　 SDS法（蛋白酶K法） 其它

DNA提取注意事项 真核生物基因组DNA为双链线性分子，存在于细胞核内。基因组DNA的提取过程包括：DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离、DNA的沉淀等过程。 分离纯化核酸的总原则： 1.保证核酸一级结构的完整性； 2.排除其它分子的污染，如：（1）对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；（2）生物大分子，如蛋白质、多糖和脂质；（3）其它核酸分子，如RNA。

DNA提取流程图 新鲜脾细胞 蛋白变性 上层溶液 细胞裂解 加高盐 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液

三、材料 新鲜组织 培养细胞 低温保存的组织/细胞 新鲜或冻存的抗凝血（肝素/EDTA）

注意： 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）

四、细胞裂解的方法 一、化学方法 1、渗透压冲击：低渗环境可使某些细胞破碎 2、增溶法：以表面活性剂增加细胞膜的水溶 性。 3、碱裂解法 二、物理方法 玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 三、生物方法 酶解法：溶菌酶可用于细菌的破碎 注：根据不同的实验要求选取不同的细胞破碎方式，应当保证要提取的物质不受损伤

SDS，十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 注意： 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞/血液－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠

五、分离及纯化的常用方式 1、离心及沉降：基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中发生沉降，密度不同沉降速率也不相。 2、萃取：利用两个不相混容的液相中各组分溶解度不同，达到分离的目的。 3、吸附与解离：利用吸附剂对液体或气体某一组分具有选择性吸附的能力，进行分离。 4、沉析：利用沉析剂使要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。 5、色谱 6、结晶 注意：在一个纯化过程中往往需要几种技术手段的综合使用。

注意：针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 1、蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理

a. SDS及蛋白酶K可有效的使DNA与蛋白质解离。 b. 盐析：中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在 低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析 。 中和蛋白质分子所带电荷 破坏蛋白质分子周围的水化膜

六、真核细胞基因组提取的步骤： 破碎细胞。 去除蛋白质，糖类等细胞内杂质。 最后纯化出ＤＮＡ。 注意事项：由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。

多糖的去除： 盐离子的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤

DNA的沉淀： 需要盐离子的存在 NaCl NaAc MgCl2 LiCl 为常用的盐 多种有机溶剂可做为核酸的沉淀剂 乙醇 异丙醇

注意： 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入饱和NaCL，有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解

DNA的定量 紫外分光光度法不但可以 确定核酸的浓度还可估算核酸的纯度。 OD260: 核酸的吸收峰 OD280: 蛋白质的吸收峰 OD260 /OD280 可表示DNA的纯度 OD260＝1 相当于大约50μg/ml双链DNA DNA（mg/ml）=50× OD260读数×稀释倍数/1000

DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。 若比值较高说明含有RNA， 比值较低说明有残余蛋白质存在。 OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

DNA碱基对的平均分子量 = 650 道尔顿 A260 unit ds DNA = 50 µg/ml = 0.15 mM (in nucleotides) A260 unit ss DNA = 33 µg/ml = 0.10 mM (in nucleotides) A260 unit ss RNA = 40 µg/ml = 0.11 mM (in nucleotides)

七、注意事项 1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。 4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的

八、本实验的操作过程 1、取新鲜的动物脾脏，放入Eppendorf离心管中，破碎，破红细胞膜，离心。 2、加入0.5ml TKM缓冲液，40μl Triton X-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。在台式离心机上离心，3,000rpm×8分钟。（破红白细胞膜） 3、倾去上清液，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，3,000rpm×8分钟，重复步骤3两次。（清洗） 4、于沉淀中加入200μl TKM缓冲液和45μl 10％SDS（终浓度为0.7％），9μl蛋白酶K，混匀后于55℃保温20分钟。（蛋白变性）

5、于离心管中加入80μl 饱和（≈6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为1 5、于离心管中加入80μl 饱和（≈6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为1.2 mol/L），混匀。5,000 rpm离心10分钟。（沉淀蛋白质） 6、小心吸取上清液约240μl转移至另一洁净的1.5ml Eppendorf离心管中。加入750μl 95％的冷乙醇（终浓度为71％），－20℃放置30min。离心1,1000 rpm×10分钟，最好在4℃。（沉淀DNA） 7、小心吸去上清，加入1.0 ml 75％的冷乙醇，洗涤沉淀，离心1,1000 rpm×5分钟。（脱盐）

8、弃去上清，置37℃温箱中干燥，以去除残余的乙醇。 9、将干燥后的DNA溶于50μl TE缓冲液中，置－20℃冰箱中备用；也可将干品置－20℃冰箱中备用，使用前用30μl重蒸水溶解。 10、OD260/OD280的测定。