第十二章 分子生物学常用技术 及其应用

序言 21世纪是生命科学的世纪！ 世界各国政府高度重视生物技术 生物技术正在改变人们的生活和观念 生物技术是当今发展最快、最活跃、 对社会与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其中基因工程和发酵工程是生物技术的核心。 世界各国政府高度重视生物技术 我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、 新材料等高科技领域的第二位。可见其战略地位。 生物技术正在改变人们的生活和观念 随着基因组计划的接近完成及后基因组计划的开展，借助计算机处理复杂信息的强大能力，21世纪的生物技术将会有更大发展，有些领域甚至可能有重大突破。

第一节 自然界的基因转移和重组 一、接合 二、转化 三、转导 四、转座 质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞 第一节 自然界的基因转移和重组 一、接合 质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞 二、转化 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞获得新的遗传表型 三、转导 病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞， 使后者获得新的遗传表型 四、转座 DNA片段从染色体的某处移位到另一处。

四、基因重组(recombinant) 不同DNA分子间发生的共价连接 重组的类型： 位点特异性重组 (site-specific recombination) 2. 同源重组 （homologous recombination）

1. 同源重组（homologous recombination） 机制 B A a b B A b a A a B b B a A b a b A B 同源区 功能 1. 在减数分裂过程中，同源染色体之间 进行交换，形成生物个（群）体的多样性。 2. 是DNA损伤修复的重要机制之一。

2. 位点特异性的基因重组 由整合酶催化，重组仅在特定的基因片段和位点上进行。 是免疫球蛋白多样性的分子机制。

第二节 基因工程的工具 ——工具酶和载体

一、 常用的工具酶 (一)限制性内切酶(restriction endonuclease) ---切——基因工程的手术刀 没有限制性内切酶的发现和应用，就很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。 识别双链DNA中特异序列，该序列的特征为4-6个核苷酸的回文结构，并在识别序列内或附近特异切割DNA，产生粘性末端或平末端。 功能： 根据需要在特定的位点精确切割 双链DNA分子

1. 产生5′突出粘性末端(sticky end) 作用模式图： 1. 产生5′突出粘性末端(sticky end) **********GAATTC******** **********CTTAAG******** 5′ 3′ EcoR I *********G *********C T T A A 5′ 3′ —OH — P A A T T C********* G********* 5′ 3′ P OH—

作用模式图： 2. 产生3′突出粘性末端 Pst I 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ —OH P OH— P 2. 产生3′突出粘性末端 **********CTGCAG************** **********GACGTC************** 5′ 3′ Pst I 5′ 3′ —OH — P *********C T G C A *********G 5′ 3′ OH— — P A C G T C*********** G***********

作用模式图： 3. 产生平末端(blunt end) Alu I 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ *************AGCT************* *************TCGA************* 5′ 3′ Alu I 5′ 3′ OH— — P CT************* GA************* 5′ 3′ —OH — P *************AG *************TC

限制性内切酶用途： 基因重组过程中切割DNA以获取目的基 因片段，切割载体形成切口，使目的基因能插入载体中。 2.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP)分析：遗传病的诊断，法医 DNA指纹分析等。 3.构建DNA的物理图谱，基因定位，DNA的 同源性分析等等。

(二)DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针 功能： 将两条双链DNA片段连接起来，实现 DNA的体外重组。

DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。 也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA，但效率很低。 如需连接单链DNA或RNA，则需用RNA连接酶。

DNA连接酶 作用模式图： 1. 连接粘性末端 DNA连接酶 EcoR I A A T T C********* G********* 5′ 1. 连接粘性末端 A A T T C********* G********* 5′ 3′ — P OH— *********G *********C T T A A 5′ 3′ —OH — P **********GAATTC********** **********CTTAAG********** 5′ 3′ DNA连接酶 EcoR I

作用模式图： 2. 连接平末端 DNA连接酶 Alu I — 5′ 3′ ************TC ************AG 5′ 作用模式图： 2. 连接平末端 —OH — P 5′ 3′ ************TC ************AG 5′ 3′ OH— — P CT************* GA************* *************AGCT************** *************TCGA************** 5′ 3′ DNA连接酶 Alu I

(三) 反转录酶(Reverse Transcriptase) 功能： 1. RNA指导的DNA聚合酶活性： 以RNA为模板，以带3′-OH末端的DNA片段为引物， 沿5′至3′方向合成DNA链。 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT—OH 3′ dNTP Mg2+ 反转录酶 3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′ 5′TTTTTTT AGACAGGAT……3′

功能： 2. DNA指导的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H活性；DNA解旋酶活性等。 用途： 1. 反转录酶的最主要作用是以mRNA 为模板合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)。 2. 以单链DNA或RNA为模板制备探针。

(四) 核酸酶S1 功能： 水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。 核酸酶S1 核酸酶S1 + 核酸酶S1

(四)核酸酶S1 用途： 1. 除去双链DNA的粘性末端以产生 平末端； 2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构； 3. 分析RNA的茎环结构以及DNA- RNA分子的杂交情况等。

催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。 功能： 催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。 底物是单链DNA或有3′突出末端的 双链 DNA。 Mg2+ 5′ 3′ 5′ 3′ OH (A、G、C、T)n dNTP nppi Mg2+ OH (A、G、C、T)n 5′ 3′ 5′ 3′ dNTP nppi

2.底物是平端或3′ 凹端的双链DNA。 5′ 3′ 5′ 3′ Co2+ nppi Co2+ 5′ 3′ 3′ nppi 5′ OH (A、G、C、T)n dNTP nppi Co2+ OH (A、G、C、T)n 5′ 3′ 3′ dNTP nppi 5′

用途： 1. 主要作用是在载体或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。 2. DNA 3′末端的同位素标记。

(六) 核糖核酸酶H 功能： 水解DNA-RNA杂交分子中的RNA链。 用途： 用核糖核酸酶H部分水解mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，使未被水解的mRNA作为引物合成cDNA的第二链。

二、载体(vector) 作为基因工程载体所需具备的基本条件： 1. 能自我复制，并具一定的拷贝数。 2. 带有抗性基因，便于筛选和鉴定。 目的基因进入原核或真核细胞并高效复制 和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。 作为基因工程载体所需具备的基本条件： 1. 能自我复制，并具一定的拷贝数。 2. 带有抗性基因，便于筛选和鉴定。 3. 在适当的位置有单酶切位点，便于重 组操作。 4. 带有强启动子，驱动目的基因在宿主 细胞内高效表达。

基因工程载体的种类和用途： 1. 细菌质粒：最常用的用于目的基因克隆或 2. 噬菌体： 主要用于构建基因组DNA或 1. 细菌质粒：最常用的用于目的基因克隆或 表达的载体。 2. 噬菌体： 主要用于构建基因组DNA或 cDNA文库。 3. M13噬菌体：专用于Sanger双脱氧DNA 测序 4. 粘粒：用于克隆大片段DNA。 5. 酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白。 6. 病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物病毒。用于在真核细胞中表达目的蛋白。

(一) 质粒(plasmid) 定义:细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。 质粒 染色质 细菌培养 大肠杆菌 质粒扩增并表达蛋白质

pBR322质粒：一种克隆质粒 结构： ORI：复制起始点， 两个单酶切位点用于插入目的基因 保证高拷贝自我复制。 Ampr, Tetr： 两个抗性基因用于 筛选阳性克隆。 Tetr Pst I, BamH I： ORI 两个单酶切位点用于插入目的基因

pfxBlue: 克隆质粒 MCS：Multiple Clonning Site 提供多个单酶切位点用于克隆操作 Ampr MCS LacZ

pRS426：原核细胞表达质粒 P(LacZ)： LacZ启动子 用于在原核细胞驱动目的基因的表达。 LacZ Ampr MCS

pcDNA3：真核细胞表达质粒 驱动目的基因在真核细胞内表达 目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。 Pcmv： CMV增强子/启动子 BGH pA：加尾信号 目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。

(二) 噬菌体(phage) 1. 噬菌体(phage) 2. 粘粒(cosmid) 3. M13噬菌体

1. 噬菌体 插入型 置换型 重组区 目的基因 cos位点 cos 位点 EcoRI A R A R 结构区 调控区 裂解区 EcoRI 1. 噬菌体 cos位点 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR cos 位点 重组区 结构区 调控区 裂解区 EcoRI EcoRI EcoRI A R A R 目的基因 插入型 置换型

重组噬菌体的分子量必须在野生型噬 菌体 分子量大小的75%至105%之间。 筛选标记： 蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。 用途： a.用作一般的克隆载体。 b.用于构建基因组或cDNA文库。 c.用于抗体库或随机肽库的构建。

2. 粘粒(cosmid) 组成： 1. 质粒复制的起始位点(ORI)； 2. 抗性基因； 3. 用于插入目的基因的单个酶切位点； 2. 抗性基因； 3. 用于插入目的基因的单个酶切位点； 4. 噬菌体的cos位点。 可见，cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。

特点： 可插入长达27～41kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。 加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将 粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。 粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体 的功能，而表现质粒的特性。

3. M13噬菌体 在细菌内的复制模式图 复制 正链 滚环复制 释出单链DNA(正链) 3′ 5′ 经pII蛋白 造缺口 复制型 噬菌体 进入下 一循环 5′ 3′ 3′ 经pII 蛋白 剪切 5′ 滚环复制 释出单链DNA(正链) 在细菌内的复制模式图

M13噬菌体几个重要特点： 1. M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降 低宿主细胞的生长速度。 2. M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。 3. 克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。

M13噬菌体用途： 1. DNA序列测定； 2. 制备单链DNA探针； 3. 用于定点突变的研究。

第三节 基因工程的步骤

分、切、接、转、筛 基因工程的基本步骤 + + 1.基因工程的上游技术：基因重组 目的基因 载体 含重组子的阳性克隆 连接 转化、筛选和鉴定阳性克隆 含重组子的阳性克隆 分、切、接、转、筛

基因工程的基本步骤 2. 基因工程的下游技术： (1) 发酵工程 2. 基因工程的下游技术： (1) 发酵工程 发酵条件(生物反应器结构、细菌培养温度、空气通量、pH及培养基成分等)的优化组合。 (2) 蛋白质的分离、纯化与质量鉴定

一、 目的基因的制备—分 (一) 人工合成法(也即化学合成法) 本方法适用于分子量较小的目的基因 (100bp以内)。 缺点： 1. 只能合成较小片段的DNA(100bp以内)。 2. 如目的基因DNA序列需通过氨基酸序 列推测，难于保证与天然基因序列一 致，往往导致表达效率大大降低。

(二)反转录法 本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。

(二)反转录法： 方案： 扩增出大量的产物 双链cDNA 加热变性 TTnT 5′ AAnA 加入特异性引物 mRNA 反转录酶 cDNA 3′ 加入特异性引物 mRNA 反转录酶 3′ cDNA TTnT 5′ AAnA 3′ 5′ mRNA DNA聚合酶 核糖核酸酶H cDNA 3′ TTnT 5′ DNA poly I 重复上述步骤 核酸酶S1 扩增出大量的产物 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR) 双链cDNA

(三)直接从染色体DNA中分离 根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用合适的限制性内切酶切割染色体DNA，分离目的基因。 本方法较适用于制备原核生物目的基因，其原因为： 1. 真核细胞染色体DNA有丰富的内含 子，在原核细胞中转录后不能剪接。 2. 真核细胞的基因多数为单拷贝，难 于分离到足够的目的基因。

(四) 从基因文库(gene library)中获取 cDNA文库： c-文库 (常用) 方法： 用目的基因上的一段 DNA做成探针与文库中的 DNA作核酸杂交，从基因 文库中“钓出”有目的基 因的克隆。 基因文库

二、构建DNA重组体---接 (一)粘性末端连接 本法适用于在质粒和目的基 因上有相同单或双酶切位点 重组质粒 用同一种或两种 目的基因 用同一种或两种 限制性内切酶酶切 本法适用于在质粒和目的基 因上有相同单或双酶切位点 DNA连接酶 重组质粒

(二)平末端连接 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ 核酸酶S1 核酸酶S1 目的基因 DNA连接酶 重组质粒 产生粘性末端 的内切酶 产生粘性末端 的内切酶 质粒 产生平末端的 内切酶 核酸酶S1 核酸酶S1 目的基因 DNA连接酶 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ 重组质粒

(三)用接头连接 + + 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ 重组质粒 接头(linker) DNA连接酶 用同一种 限制性内切酶酶切 DNA连接酶 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ 重组质粒

(四)尾接法 末端转移酶 末端转移酶 +dGTP +dCTP 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点 目的基因 内切酶 DNA连接酶 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点 重组质粒

三、将重组体(子)导入宿主细胞---转 1. 重组质粒的导入方法 大肠杆菌 感受态细胞 重组质粒 转化 transformation 0～4℃ CaCl2 感受态细胞 重组质粒 转化 transformation 含重组质粒的大肠杆菌

三、将重组体导入宿主细胞 2. 重组病毒或重组噬菌体的导入方法 重组病毒 重组噬菌体 加入病毒的 某些蛋白组分 具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒 转染(transfection) 真核细胞 原核细胞

四、重组体的筛选与鉴定---筛 1. 插入失活: 例1 在Tetr中插入目的基因 在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。 Ampr Terr

例1： 1 2 3 1 2 3 4 5 6 4 5 6 Amp Tet 3和5 是阳性克隆

四、重组体的筛选与鉴定 Apmr MCS 1. 插入失活： 例2 在Laz中插入目的基因 LacZ

例2：蓝白斑筛选 Lac-Z基因 -半乳糖苷酶 X-gal 蓝色化合物

2. 菌落原位杂交 3和5是阳性克隆 取下沾 有菌落 覆盖 的滤膜 滤膜 放射性 与探针 自显影 裂解、 杂交 变性、 固定等 1 2 3 2. 菌落原位杂交 取下沾 有菌落 的滤膜 覆盖 滤膜 1 2 3 4 5 6 放射性 自显影 与探针 杂交 裂解、 变性、 固定等 3和5是阳性克隆

五、基因工程的下游技术 (一) 细菌发酵 发酵条件(生物反应器的结构、细菌 培养的温度、空气的通量、pH及培养基 成分等)的优化组合。 (一) 细菌发酵 发酵条件(生物反应器的结构、细菌 培养的温度、空气的通量、pH及培养基 成分等)的优化组合。 (二) 蛋白质的分离、纯化与质量鉴定

六、基因工程中几个棘手的问题 1. 原核细胞的RNA聚合酶不能识别 真核细胞的启动子。 2. 原核细胞不能剪接真核细胞 带内含子的mRNA。 3. 原核细胞表达出的真核细胞蛋白质 往往无活性。 4. 用真核细胞表达系统虽然可以表达有活性的蛋白质，但其产量太低，成本太高。

第四节 基因工程在医学上的应用 现代医学越来越重视活性蛋白质在预防 和治疗疾病中的作用。 基因工程可大量生产天然稀有存在的 第四节 基因工程在医学上的应用 现代医学越来越重视活性蛋白质在预防 和治疗疾病中的作用。 基因工程可大量生产天然稀有存在的 重要的肽或蛋白质。 基因工程可根据人的意愿设计生产出 天然不存在的有重要生物活性的肽或 蛋白质。 人类基因组计划及后基因组计划的成果 将为基因工程提供难于估量的广阔发展 空间。

一、基因工程生产的药品 1.基因工程疫苗 乙肝，丙肝，爱滋病，流行性感冒，出血热，人乳头瘤病毒，巨细胞病毒等。 结核，麻风，霍乱，痢疾，肺炎等。 血吸虫，疟疾等。 各种肿瘤疫苗。 ……

2. 人体活性因子 干扰素(IFN)： IFN-，IFN-，IFN-。 白细胞介素(IL)： IL-1，2，3……13。 生长因子： 神经生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子等。 集落刺激 因子(CSF)： 干细胞-CSF，粒细胞-CSF，粒细胞-巨噬细胞-CSF。

2. 人体活性因子 治疗心血管及血液病的活性肽 红细胞生成素(EPO)，超氧化物歧化酶(SOD)，组织纤溶酶原激活物(tPA)等。 激素 胰岛素，生长激素，生长抑制激素等。 ……

主要发展趋势 完善现有的原核和真核细胞表达体系 建立新的表达体系 改进和发展大规模动、植物细胞培养技术 应用转基因动、植物作为生物反应器高产量、高质量、低成本生产名贵生物药物。

二、 基因诊断 基因诊断的概念 基因诊断所应用的主要技术 聚合酶链反应(PCR) 核酸探针技术 将痕量的难于检测到的特定的基因片段成百万地特异地扩增。 核酸探针技术 用已知的与疾病相关或特异的核酸片段(探针)与待测样品作核酸杂交，检测样品是否有该特征性DNA片段以及量的多少。

核酸探针技术 Southern Blot: 印迹DNA Northern Blot: 印迹RNA 原位杂交技术 寡核苷酸探针技术 RT-PCR PCR-单链构象多态分析(PCR-SSCP)

基因诊断的疾病谱： 遗传性疾病，感染性疾病，心血管疾病，肿瘤，... 发现并获得某种疾病的特异性基因是基因诊断的基础。 人类基因组计划，后基因组计划，特别是疾病基因组计划将极大地推动这一进程。

三、基因治疗(gene therapy) 定义： 一切通过基因水平的操作而达到， 治疗疾病目的疗法。 基因治疗的策略 1.基因置换：以正常基因替换缺陷基因。 2.基因补偿：导入正常基因，补偿缺 陷基因的功能。 3.基因失活：用反义核酸封闭有害基因的表达。

4. 免疫基因治疗：将免疫增强因子基因(如MHC，IL)导入肿瘤细胞，提高其免疫原性。 5. 活化前体药物基因治疗： 向肿瘤细胞导入一种基因，该基因产物为一种酶，它可将无细胞毒的药物前体转化为有毒性的药物，从而将细胞杀死，也称自杀基因治疗。 6. 耐药基因治疗： 将抗药物毒性的基因导入对化疗药物敏感的组织细胞(如骨髓干细胞)，提高其对药物的耐受性。

目前基因治疗面临的问题 1. 目的基因的表达水平太低或难于精确控制。 2. 目的基因的转移和表达缺乏足够的 靶向性。 3. 对基因表达调控、基因表达产物的功能的认识还很少、很肤浅。