选修部分 选修3 现代生物科技专题
关 注 新 考 纲 把 握 新 考 情 1. 基因工程的诞生Ⅰ 2．基因工程的原理及技术Ⅱ 3．基因工程的应用Ⅰ 4．蛋白质工程Ⅰ 1.基因工程的实质 2．基因工程操作的四步曲及其操作实例 3．基因工程在农业、医药生产、疾病诊断和治疗中的应用 4．蛋白质工程的一般操作过程
1.1 DNA重组技术的基本工具 1．2 基因工程的基本操作程序
一、基因工程的概念及基本工具
二、基因工程的基本操作程序
议一议：限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自己的目的。 看一看：构建基因表达载体时，可能没有加入启动子。
一、基因工程的基本操作工具 1．与DNA分子相关的酶 (1)几种酶的比较
项目 种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 形成黏性末端 或平末端 DNA连接酶 DNA分子片段 形成重组DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 形成新的DNA分子 DNA(水解)酶 形成脱氧核苷酸 DNA解旋酶 碱基对间 的氢键 形成单链DNA分子
(2)限制酶与DNA连接酶的关系 ①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 ②DNA连接酶起作用时不需要模板。
2．载体 (1)作用 ①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。 ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 (2)具备的条件 ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。 ②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。 ③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。
(3)种类 ①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。 ②λ噬菌体的衍生物。 ③动植物病毒。
特别提醒 ①获取目的基因和切割载体时使用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 ②获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 ③限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。
GGATCC GAATTC AAGCTT AGATCT CCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA ↑ ↑ ↑ ↑ 跟踪训练1 (2011·河南郑州一检)限制酶可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及BglⅡ的辨识序列及每一种限制酶的特定切割部位。 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅢ BglⅡ ↓ ↓ ↓ ↓ GGATCC GAATTC AAGCTT AGATCT CCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA ↑ ↑ ↑ ↑
其中哪两种限制酶切割出来的DNA片段末端可以互补结合，其末端互补序列是( ) A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列：—AATT— B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列：—GATC— C．BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列：—GATC— D．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列：—AATT—
解析：BamHⅠ和BglⅡ切出的黏性末端碱基能互补配对，互补序列都含有—GATC—。
二、基因工程基本操作程序 1．目的基因的获取 (1)直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。 (2)人工合成目的基因的常用方法 ①已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。 ②以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。
(3)PCR技术与DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原理 DNA双链复制(碱基互补配对) 原料 四种游离的脱氧核苷酸 条件 模板、ATP、酶等
PCR技术 DNA复制 不 同 点 解旋 方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 场所 体外复制 主要在细胞核内 酶 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 细胞内含有的DNA聚合酶 结果 在短时间内形成大量的DNA片段 形成整个DNA分子
2.基因表达载体的构建 (1)基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。 (2)基因表达载体的构建方法
3．将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
4.目的基因的检测与鉴定 (1)分子水平检测 ①导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作为探针检测。 (2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。
拓展深化 ①只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。 ②工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。 ③目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。
跟踪训练2 (2011·福建福州质检)下图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下列叙述正确的是( )
A．构建重组质粒过程中需要限制性内切酶和DNA连接酶 B．愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C．卡那霉素抗性基因(kanr)中有该过程所利用的限制性内切酶的识别位点 D．抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传
解析：质粒与目的基因结合时需要用同一种限制性内切酶切割，切出的黏性末端相同，可用DNA连接酶连接；愈伤组织由相同的细胞分裂形成，分化后产生相同基因型的植株；卡那霉素抗性基因作为标记基因不能有限制性内切酶的切割位点，标记基因被切断后不再表达；抗虫棉为杂合子，其有性生殖后代可能会发生性状分离，抗虫性状不一定能稳定遗传。 答案：A
题型一 基因工程的基本工具 【例1】 如图为DNA分子的切割和连接过程：
(1)EcoRI是一种________酶，其识别序列是________，切割点是________与________之间的________键。切割结果产生的DNA片段末端形式为________。
【标准解答】 本题考查DNA限制酶和DNA连接酶的有关知识。(1)从图中可看出EcoRI可将DNA片段切割，应为限制酶，其识别序列是GAATTC，切点是G与A之间的磷酸二酯键，切割后产生的是黏性末端。(2)DNA连接酶可将不同来源的DNA片段结合，由图中可看出，此酶是通过在G与A之间形成磷酸二酯键的形式连接两片段，连接的黏性末端，对应前面的EcoRI限制酶，此酶应为E·coliDNA连接酶，T4DNA连接酶可连接平末端。
【答案】 (1)限制 GAATTC 鸟嘌呤脱氧核苷酸(或G) 腺嘌呤脱氧核苷酸(或A) 磷酸二酯 黏性末端 (2)E·coliDNA 鸟嘌呤脱氧核苷酸(或G) 腺嘌呤脱氧核苷酸(或A) 磷酸二酯 T4DNA连接酶
题型二 基因工程的基本操作程序 【例2】 科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示。根据题意，回答下列问题：
(1)基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：________、________、________、________。 (2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti质粒的TDNA中是利用TDNA的_______________特点。 (3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为__________________________。
(4)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是______________________________。 (5)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________________________________。
【自主解答】 本题以抗虫棉的培育为背景，考查了运用基因工程技术生产转基因作物的步骤、方法。农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，利用它能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，以及其Ti质粒上的TDNA能转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上的特点，可以把目的基因插入其Ti质粒的TDNA中，借助其作用使目的基因成功导入受体细胞。
【答案】 (1)目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 (2)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上 (3)转化 (4)农杆菌转化法 (5)目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上 DNA分子杂交技术
规律总结：熟悉基因操作四个步骤中一些重要考点 ①提取目的基因 方法：a.直接分离法(鸟枪法)： 提取供体细胞(DNA) 得到许多DNA片段―→分别与运载体结合―→分别导入受体细胞―→在细胞中复制扩增―→分离目的基因
②目的基因与运载体结合 用同一种限制酶切割目的基因和质粒；用DNA连接酶连接目的基因和质粒。 ③目的基因导入受体细胞 重组质粒导入受体细胞(动植物细胞、微生物细胞、CaCl2处理的细菌等。)
④目的基因的检测和表达 检测：通过检测标记基因的特征，判断目的基因是否被导入受体细胞。 表达：通过检测和观察生物的性状变异，判断目的基因是否成功表达。
一、选择题 1．(2010·浙江高考)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是( ) A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C．将重组DNA分子导入烟草原生质体 D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
解析：构建抗除草剂的烟草要用限制性核酸内切酶切割杂草中含抗除草剂基因的DNA与运载体。
2．(2010·全国卷Ⅱ)下列叙述符合基因工程概念的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
解析：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，进而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。B细胞与肿瘤细胞融合，属于细胞工程；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，进而筛选出青霉素高产菌株，属于人工诱变；自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，并没有进行人为的加工，不属于基因工程。 答案：B
3．(2009·浙江高考)下列关于基因工程的叙述，错误的是( ) A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
解析：胰岛素原须在内质网、高尔基体中加工后才有生物活性，大肠杆菌无内质网和高尔基体。载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞，但由于它和目的基因是相互独立的，并不能促进目的基因的表达。
4．已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是( ) A．3 B．4 C．9 D．12
解析：若每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则多个线性DNA可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种。
5．(2010·江苏高考)下列关于转基因植物的叙述，正确的是( ) A．转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中 B．转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加 C．动物的生长激素基因转入植物后不能表达 D．如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
解析：若把抗除草剂基因导入油菜的细胞核中，则会在减数分裂时进入配子，然后随花粉进入环境。抗虫植物会对捕食它的昆虫群体进行自然选择，导致昆虫群体抗性基因频率增加。条件允许时，动物基因同样可以在植物体内表达，在修饰和改造后也可以在原核生物体内表达。转基因生物的外源基因不管是来源于自然界还是由人工合成，都可能存在安全性问题。 答案：A
二、简答题 6．(2010·江苏高考)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ 识别序列及 切割位点 ↓ GGATCC CCTAGG ↑ AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG ↓ CCCGGG GGGCCC ↑
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基因。 (3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________________________________。 (4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止___________________。
(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。 (6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_____________。 (7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
解析：(1)切割前质粒为环状，不含游离的磷酸基团。切割后质粒成了一个链状的双链DNA分子，含两个游离的磷酸基团。 (2)因为SmaⅠ识别序列中均为G—C碱基对，G、C之间含三个氢键，热稳定性高。 (3)据图可知，SmaⅠ既会破坏标记基因，也会破坏目的基因。 (4)若用同种限制酶切割质粒和外源DNA中的目的基因，因为两端的黏性末端相同，会出现自身环化的情况。而用两种限制酶切割，因为两端形成的黏性末端不同，不会出现自身环化。
(5)DNA连接酶可以连接具有相同黏性末端的DNA片段。 (6)标记基因可以鉴别受体细胞是否含有目的基因。 (7)把蔗糖作为培养基的唯一碳源，可以把不能完成目的基因表达的受体细胞淘汰掉。
答案：(1)0、2 (2)高 (3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 (4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 (5)DNA连接 (6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞 (7)蔗糖为唯一含碳营养物质
7．右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：
(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有____________、__________、____________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行________________。
(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是______________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________________。
(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ______________，其合成的产物是 __________________。 (4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_______________。
解析：(1)在基因表达载体的构建过程中用同种限制酶来切割目的基因和质粒，使之产生相同的黏性末端，以利于DNA片段的连接。将切割后的目的基因和质粒，用DNA连接酶进行连接，它们之间随机连接，可有三种产物：目的基因—载体连接物、载体—载体连接物和目的基因—目的基因连接物。获得DNA连接产物以后，必须通过筛选才能获得所需的基因表达载体，导入宿主细胞后才能表达获得基因产物。
(2)从图中可以看出，目的基因的插入位点在抗四环素基因上，可推知：目的基因—载体连接物的抗四环素基因被破坏，丧失了抗四环素的能力，但保留了抗青霉素的能力；载体—载体连接物既保留了抗四环素的能力也保留了抗青霉素的能力；目的基因—目的基因连接物既无抗青霉素基因也无抗四环素基因，不具备抗性。(3)目的基因表达过程中，RNA聚合酶首先与启动子结合，指导目的基因转录产生mRNA，mRNA再指导蛋白质的合成。
(4)若只用EcoRⅠ(或只用BamHⅠ)切割质粒及目的基因，连接时有三种产物，所以在实际操作过程中，为避免切割后的末端任意连接，可用EcoRⅠ和BamHⅠ同时对目的基因和质粒进行切割，目的基因两端的黏性末端不同，就不存在目的基因—目的基因连接物；质粒切口处两端的黏性末端不同，就不存在载体—载体连接物，只能得到目的基因—载体一种连接物了。
答案：(1)目的基因—载体连接物、载体—载体连接物'目的基因—目的基因连接物'分离纯化'(2)载体—载体连接物'目的基因—载体连接物、载体—载体连接物'(3)启动子'mRNA'(4)EcoRⅠ和BamHⅠ