分子细胞遗传学技术 与产前诊断 南京大学医学院 王亚平 2006年11月

基因诊断的中心问题是认识 遗传变异、基因突变 及与表型之间的关系

一、分子细胞遗传学技术

荧光原位杂交技术（fluorescence in site hybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500 kb.

荧光原位杂交技术（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特异性DNA探针 基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努力，越来越多的这方面探针可以使用 着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色体和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。 全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或仅含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种DNA序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素，在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。

应用15号染色体一基因特异性探针（红色）杂交确定其是否缺失；绿色探针鉴定15号染色体着丝粒。 24种不同染色体涂染探针杂交得到的彩色染色体

染色体技术的 应用－1 inv(14)(p12q24) t(2; 11)(2q34; 11q13)

细胞遗传学研究中染色体技术的应用—FISH技术检出 t(2; 14)

染色体技术的 应用－2 inv(9)(p12q13)

分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失

细胞遗传学研究中染色体技术的应用 21号染色体涂染探针FISH杂交，显示21三体 9号染色体涂染探针杂交。箭头示易位到10号染色体上的来自9号染色体的片段

比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH） 近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不同荧光物质分别标记肿瘤细胞DNA和正常人细胞DNA，然后与正常人中期细胞染色体杂交。 通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。 这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。

比较基因组杂交的原理

待测DNA（肿瘤细胞DNA，test DNA)为绿色 参照DNA(正常细胞DNA，reference DNA）为红色 复染为蓝色 人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交

中期染色体的DAPI的 复染图 B. 中期染色体比较基因组杂 交（CGH）：红色区域表示 丢失，绿色区域表示扩增。

CGH的优点： 经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水平对待检基因组DNA序列拷贝数改变进行检测和定位。 无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体瘤尤为适用。 所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检测，利于做回顾性研究。

CGH的局限性： 难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基因重排，倍体水平改变。 结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在，肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。 灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10 — 30MB）

二、突变分析与分子诊断

（一）基因突变类型 点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变中最多见的形式。 稳定突变：传递中不改变原有的突变。 动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生明显变化。

点突变的结果： （1）同义突变（samesense mutation）：碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变。 （2）错义突变（missense mutation）：碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸。 （3）无义突变（nonsense mutation）：碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 （4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改变蛋白质功能的“错义突变”

基因突变形式—碱基的插入和缺失 碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。

碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码产生截短型蛋白 缺失突变

基因突变形式 框内突变（inframe mutation）：3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸。 DNA 大片段缺失或复制（large deletion or duplication)：几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。

各种类型病理性突变的比例 无义突变和移码突变： 60％ 稀有的错义突变： 20％ DNA大片段缺失或重复: 20％ 无义突变和移码突变： 60％ 稀有的错义突变： 20％ DNA大片段缺失或重复: 20％ 另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位点 微小突变

（二）目前常用的对已知点突变的分析技术 限制性片段长度多态性（RFLP） 等位基因特异性（PCR）扩增（ASA） 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO） DNA芯片

1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析 当突变影响到某一限制性内切酶位点时，可通过酶切PCR产物，电泳分析:限制性片段长度多态性（RFLP）

2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA） 通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，分析结果。

3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO） 设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的位点，一段与野生型链互补，一段与突变型链互补。 杂交分析是否存在突变

4.基因芯片：SNP位点的检测

Microarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorphisms using dual-color fluorescence hybridization. Mutat Res. 2004; 548: 97-105

（三）目前常用的未知基因突变分析技术 异源双链体形成分析（ Heteroduplex analysis, HA） 单链构象多态性分析（Single-strand conformation analysis, SSCP） 变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE） 变性高效液相色谱分析（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC ）

体外蛋白截短实验（Protein truncation test, PTT） 定量多重PCR技术（Quantitative multiplex PCR, QM-PCR） 多重探针连接依赖性扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation, MLPA) DNA序列分析（DNA sequencing)

1.异源双链体形成分析（HA） 由突变型和野生型DNA链形成的异源双链DNA在其错配处形成一个凸起，电泳时会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率，从而使两者得以分离。 技术路线：PCR产物95C变性5分钟，37C复性10分钟。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（0.2%硝酸银染色）

2.变性梯度凝胶电泳（DGGE） 利用不同DNA序列开始变性时对变性剂浓度的要求不同，在变性剂浓度梯度凝胶内电泳，野生型DNA和突变型DNA序列的差异所导致其变性点不同使两者的电泳迁移率出现差异

3.单链构象多态性分析（SSCP） 单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳迁移率的差异。 技术路线：PCR产物95C变性5分钟，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液0.5TBE，电压70v, 4C环境下电泳过夜（0.2%硝酸银染色）。

4.体外蛋白截短试验（PTT） 从蛋白质水平检测基因的突变。其原理是碱基缺失和插入导致的移码突变、碱基替换出现的无义突变均可使基因提前出现终止密码，从而截短mRNA翻译的蛋白质。 技术路线：血细胞RNAcDNART-PCR体外蛋白质合成电泳分析截短了的蛋白质相应基因片段的序列分析

上游引物5’端均连接T7启动子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG [35S]甲硫氨酸，T7 体外转录/翻译体系（兔网织红细胞提取物），30℃孵育90 min，完成体外蛋白质合成。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.变性高效液相色谱分析（DHPLC） 1995年Oefner and Underhill 首次报道DHPLC技术。其原理是在接近DNA融解温度条件下进行离子对反相高效液相色谱分析。 DHPLC分析突变的原理：在DNA部分变性的条件下，变异型和野生型DNA可形成同源双链和异源双链．根据其在层析柱上保留的时间可以分辨出变异性型DNA.

用离子对反相高效液相色谱检测DNA变异是基于同时存在同源双链和异源双链。异源双链的检出取决于高效液相色谱的温度。而色谱温度的选定与野生型DNA融解温度（Tm）有关。 DHPLC与其它突变分析技术的比较: 对单个核苷酸变异的检出率: SSCP技术, 约75%； DHPLC, >90%.

DHPLC的优点： 灵敏，准确； 分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟； 容易实现自动化操作； 适用于较大样本中基因突变的筛选。

DHPLC分析：（野生型）

DHPLC分析: 突变型（单个碱基改变）

DHPLC分析: 突变型（单个碱基改变）

6.定量多重PCR技术（Quantitative multiplex PCR，Q-M-PCR） 目前各实验室普遍采用的突变基因分析技术对基因微小突变的检测具有较高的敏感性，如对单个碱基改变的检出率可达90%以上。但对于较大的DNA缺失或DNA重复产生的突变，如以外显子为单位的DNA缺失，SSCP、DHPLC等均难以将其检出。有资料表明大片段DNA缺失可占基因突变的三分之一

定量多重PCR技术要点： 涉及至少2个基因的多个外显子在一个反应管内同时进行PCR扩增，其中一个外显子作为参照外显子，其余作为检测外显子； PCR产物于DNA测序仪电泳，其结果经GeneScan软件处理；

以检测外显子PCR产物与参照外显子PCR产物的比值计算模版DNA相对拷贝数，确定是否存在检测外显子的杂合性缺失；

7. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation — MLPA Denatured genomic DNA is hybridized with a mixture of more than 40 probes. Each MLPA probe consists of two oligonucleotides, one synthetic and one M13-derived. The two part of hybridized probes are ligated. All probe ligation products are amplified by PCR using only one primer pair. Electrophoresis of PCR products on DNA Sequencer in GeneScan model.

三、遗传性疾病的诊断

遗传性疾病的诊断： （一）临症诊断 （二）症状出现前的诊断 （三）产前诊断

（一）临症诊断 根据就诊患者的临床表现作出（初步）判断：疾病诊断，遗传方式 （1）症状、体征 （2）系谱分析 部分遗传性疾病的诊断主要依赖于症状、体征 对于同时存在散发病例和遗传性病例的复杂性疾病，如肿瘤，建立相应的临床可疑病例的判定标准 根据不同的遗传性疾病，选择适当的实验室技术分析确诊： 生化技术、细胞技术、分子技术 多用于对先证者的诊断

Pedigree of a family

遗传性疾病基因诊断程序 临床诊断和确定分析对象 确定分析的目标基因 以检测目标基因的结构确定分析的技术构成和分析过程： 基因微小变异筛查：SSCP, DGGE, DHPLC, PTT, DNA测序分析 基因大片段变异（缺失或重复）的分析 检出变异的性质评估和患者家族的遗传咨询。

DHPLC突变分析

体外蛋白截短试验 （PTT） — HNPCC遗传性突变

DNA序列分析—碱基替换

DNA序列分析—移码突变

DHPLC—外显子缺失

APC 基因型和患者临床表型关系的研究 (1) APC基因胚系突变与FAP临床表型的相关 : 位于第1309位密码子附近的突变，患者临床症 状严重。 (2) APC基因体细胞突变与CRC生物学特征： APC基因体细胞突变 有转移 无转移 含1114密码子突变的CRC患者 5 未见1114密码子突变的CRC患者 5（38.5%) 8 Fisher’s exact test: P=0.03

（二）症状出现前的诊断 应用于发病年龄延迟的遗传性疾病。 应用于已知遗传性疾病家族的目前表型正常的个体。 单基因显性遗传病的杂合子个体。 动态突变的分析。 结合于遗传咨询工作。

对家庭其他人员进行症状出现前的基因分析 A.异源双链体形成分析（HD） B. 单链构象多态性分析（SSCP） A B

（三）产前诊断 分析指征 出生缺陷监测 （1）夫妇之一存在染色体畸变，或曾生育染色体病患儿； （2）有畸形儿生育史； （3）有原因不明的习惯性流产孕妇； （4）夫妇之一有先天性代谢缺陷，或曾生育这类患儿； （5）X连锁遗传病基因携带者孕妇 （6）有遗传病家族史，有系近亲婚配的孕妇 出生缺陷监测

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