液相质谱联用仪(LC-MS/MS)的应用 ——以孔雀石绿的检测为例 中山大学公共卫生学院 曾晓雯 2012.5
孔雀石绿（C23H25ClN2）是一种染 料类杀菌剂，渔民用它来预防鱼 的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等， 而且为了使鳞受损的鱼延长生命， 在运输过程中和存放池内，也常 使用孔雀石绿。
孔雀石绿有高残留性和致癌、致畸、 致突变等作用； 2002年5月中国农业部已将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药 及其化合物清单》； 2005年8月，福建、江西及安徽等地出口的鳗鱼产品，被验出含 有孔雀石绿，国家质检总局首次下令全面回收。数日后香港更发 现多种淡水鱼含有孔雀石绿，中国因此禁止所有淡水鱼出口到香 港。同年9月1日香港在来自台湾的青斑海鱼样本中验出孔雀石绿； 国标规定（ GB/T19857-2005 ）：1μg/kg
实验目的 1. 了解高效液相色谱-串联质谱的基本结构； 2. 熟悉LC-MS/MS常用几种检测模式，会（1）应用全扫 描模式找孔雀石绿的分子离子峰，（2）应用子离子扫 描模式找孔雀石绿的二级特征碎片离子，并（3）应用 多重反应监测（MRM）测定样品孔雀石绿的含量。
液相(HPLC)到质谱(MS)的接口 质谱分析仪(MS) 液相(HPLC) Interface (Key to Success!) HPLC 2017/3/18 液相(HPLC)到质谱(MS)的接口 质谱分析仪(MS) 需要高真空条件 质量分析系统 最好使用挥发性缓冲液 液相(HPLC) 高效分离混合物 出口压力为大气压 可以使用缓冲盐溶液 HPLC MS Interface (Key to Success!) by Li Ping
真空系统 检测器 质量分析器 离子源
离子源：电喷雾(ESI)的电离过程 带电液滴 溶剂离子束 分析物离子 库仑爆炸 （Coulomb Explosions） 溶剂蒸发 + - 2017/3/18 离子源：电喷雾(ESI)的电离过程 带电液滴 + - 溶剂蒸发 + - 溶剂离子束 + + - Rayleigh Limit Reached 分析物离子 + 库仑爆炸 （Coulomb Explosions） by Li Ping
液质联用的电喷雾(ESI)接口 液相的入口 锥孔 透镜 雾化气入口 毛细管 八极杆 四极杆 雾化器 高能打拿极/电子倍增器 加热 N2 2017/3/18 液质联用的电喷雾(ESI)接口 高能打拿极/电子倍增器 液相的入口 锥孔 透镜 雾化气入口 毛细管 八极杆 四极杆 雾化器 + + Neutral Molecules Analyte Ions Clusters Salts + + + + + + + + + + + + + + + + 加热 N2 by Li Ping
ESI电离原理 正离子模式 负离子模式
质量分析器 质量分析器：是质谱仪中将离子按质荷比分开的部 分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相 同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。
四级杆：在两个相对的极杆之间加电压(U+Vcost)， 在另两个相对的极杆上加-(U+Vcost)。离子进入可变 电场后，只有具合适的曲率半径的离子可以通过中心 小孔到达检测器。
实验室现有的质量分析器类型 串联四极质谱仪(MS/MS)：三重四极（QqQ） MS1 CID MS2 Q1 q2 Q3 离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器 MS1 CID MS2 Q1 q2 Q3 选择一定质荷比的离子通过一级质谱(MS1)，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体进行碰撞诱导裂解(collision—induced dissociation，CID)，发生离子一分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱(MS2)进行分析
三重四级杆QQQ 全扫描(Full Scan) 子离子扫描(Product ion Scan) 多反应监测(MRM)
（1） 全扫描 全扫描用于检测离子源产生的离子流中，各种离子的m/z 和强度。从全扫描得到的信息可以知道目前样品中的组分 状态； 全扫描模式下三重四极杆只有一把四极杆发挥了功能。这 种模式仅仅是为了对样品有个初步的了解。挑选需要进一 步分析的离子 。
（2） 子离子扫描 (product ion scan) MS1 CollisionCell MS2 这时Q1工作在SIM模式，即只允许母离子这一种m/z的离子通过； Q2碰撞室工作在碰撞碎裂模式（CID）； Q3在做全扫描，检测Q2产生的子离子碎片m/z和强度。 用MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱 图只能是由指定母离子经碰撞产生。
子离子扫描可以得到母离子的碎片信息。这些信息可以帮助 操作者了解母离子的结构信息，区别几种m/z相同的母离子， 降低假阳性率。
(3) 多重反应监测 多重反应监测(MRM)是三重四极杆最强大的功能 一种母离子变成碎片就包含了多个反应： 化学反应：A a+b+c 通过Q1选择A，Q2碎裂A变为a、b、c，Q3测量a或b或c 的强度，就可以知道A a+b+c这一化学反应的强度，间 接知道反应物A的强度，据此可以对A进行定量
指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静 态的; MS1 CollisionCell MS2 指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静 态的; 由于通过Q1和Q2两重选择，可以限定母离子m/z和子离子 m/z两个参数。母离子和子离子m/z相同的情况，大多属于 具有同分异构体关系的样品，出现的概率较低，所以MRM 的选择性极高。
LC-MS/MS(安捷伦,6410)的基本操作
1. 仪器使用一段时间后需要调谐
2. 建立方法 （1）双击桌面MassHunter 数据采集图标，进入MassHunter数 据采集界面。 在这个界面中完成所有的方法编辑，这里有HPLC 和QQQ各 参数项的弹出菜单。
（2）点击自动进样器菜单，设定进样量，设置自动进样器的参数。 建议设置带洗针的进样，这样可以显著减少样品交叉污染。 （3）输入泵的流量、流动相比例。 （4）在柱温箱编辑画面输入柱温箱温度。 （5）在MS QQQ 参数画面， 注意为方法选合适的调谐文件， 缺省 的调谐文件为Atune.TUNE.XML
安捷伦LC-MS/MS质谱参数的设定 Time Segments ：如果你有多种化合物需要分析，可以根据保留 时间的不同，分成若干个时间段，每个时间段内只对相应的几种 化合物进行采集，有助于提高一起灵敏度。 MS1 Res、MS2 Res：质谱1和质谱2的分辨率，设为Unit。 Fragmentor：裂解电压，对于离子源内CID和离子传输起作用。 优化fragmentor，保证母离子的最大传输效率，即尽可能多到达 碰撞池。通常分子量越大、裂解电压需要越高。 Collision Energy：碰撞能量，二级质谱CID所需离子的加速电压 ，通常在50V一下。 Dwell：驻留时间，四极杆一次采集特定的离子的时间。
在方法编辑界面中可设置QQQ 的离子源参数：Gas Temp., Gas Flow, Nebulizer, Capillary etc.
3. 提取色谱图 （1）双击桌面Agilent Masshunter Qualitative Analysis 图标， 然打开数据文件； （2）在打开的谱图上单击右键，选择Extract Ion Chromatogram，然后在Type 处选择，在m/z Values(s):处输入 要提取的质量数或范围，选择OK 即可。
（3）要对谱图进行积分，选择Integrate(MS)等。然后选择执行 绿色箭头进行积分。面积列表可以点击积分列表来观看。
实验原理 利用液质联用LC-MS/MS的ESI离子源的正离子模式检测样 品孔雀石绿的含量; 孔雀石绿含有氨基,容易得到H+而形成较为稳定的[M+H]+准 分子离子,因此选择ESI正离子电离模式。
孔雀石绿的测定 孔雀石绿分子量364.9 Ion Sourcex ESI Ion polarity Positive Gas Temp. Gas Flow 11L/min Nebulizer 35 psi Capillary 4000 v MS Res. Unit
孔雀石绿的测定 （1）全扫描模式，找出孔雀石绿的分子离子m/z，即一级 质谱的母离子。 Segment Name Start mass End mass Scan Time Fragmentor Polarity MG 100 Positive
孔雀石绿的测定 （2）子离子扫描模式，找出孔雀石绿的特征碎片离子； 灵敏度最高的碎片离子可以作为MRM模式的定量离子， 次级灵敏的碎片离子可以作为辅助定性离子 Compound Precursor Ion MS2 from MS2 to Scan Time Fragmentor Collision Energy Polarity MG 100 40 Positive
孔雀石绿的测定 （3）利用前面扫描模式找到的母离子和子离子，用MRM 扫描模式做标准样品，记录积分峰面积作标准曲线图，计 算2个样品中孔雀石绿的含量。 MRM模式 Compound Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy MG 100 40 标准曲线浓度(µg/L) 1 5 10 20 50 积分面积
实验报告 简述几种常用扫描模式的基本原理； 记录孔雀石绿的母离子、特征子离子及其对应扫 描模式参数的设定； 用MRM模式，定量样品中孔雀石绿的含量
思考题 液质联用仪器的应用
5月21日周一中午把作业交到公卫学院919，谢 谢