第三章1 植物基因工程 概况 ： 1、植物的遗传学特性 2、植物转基因的克隆与分离 3、植物转基因研究常用的基因类型 4、植物基因转移的载体：病毒和质粒 5、培养转基因植物的方法 6、利用转基因技术研究基因的表达与调控 7、利用转基因植物生产外源蛋白 8、转基因植物的研究成果与安全性评价

两个封面的故事 1）今年4月中国科学家完成了全世界第一张籼稻基因组草图。 2）11月份，中国科学家又宣布完成水稻基因组第4号染色体的精确测序。 这两项重大成果，吸引国际顶尖学术杂志《科学》和《自然》均用上封面及“主打叙述”的形式予以强势报导。

里程杯的诞生 1）中国早在1992年，启动了中国籼稻为水稻基因组研究品种； 2）1996年率先在世界上完成水稻基因组物理图； 3）1998年承担第4号染色体精确测序任务（国际水稻基因组计化）； 4）2002年4月，完成世界第一张籼稻全基因组框架序列图； 5）11月完成98年承担任务。

系列成果 1.测定3500万个碱基对，覆盖第4号染色体98％区域，精确率高达 99.99％； 2.鉴定出4658个基因，并注释在染色体准确位置上； 3.首次完整测定出决定高等植物乃至高等生物染色体稳定性的着丝粒 序列，为研究其功能提供结构基础； 4.发现并鉴定了一些重复序列在染色体上的特异分布规律以及与基因 的位置关系； 5.鉴定了4号染色体上基因簇分布，预测了基因之间潜在的协同关系； 6.与籼稻广陆矮四号染色体230万个DNA碱基对进行了相应序列的同 源比较，报道了水稻2个主要亚种间基因组成、顺序及DNA序列水 平异同，发现籼稻基因组大于梗米可能从籼稻中进化而来。

科技部决定整合精兵投资两亿元 我国水稻研究整体水平已达国际领先，国家科 技部决定，将水稻功能基因组研究作为“十五”科研前沿项目，投资2亿元，整合全国优势兵力，重点开展水稻功能基因组研究，全力在水稻遗传密码破解上获取更多自主知识产权。

抗乙肝基因番茄熟了 1）只要一年吃上几个含有抗乙肝基因的西红柿就能代替乙肝疫苗，水果疫苗有望两年后上市； 2）制定一套转基因食品生产流程； 3）首批培育“疫苗番茄”分别用于乙肝和辅助治疗高血压、血友病及骨质疏松症； 4）安全性：无选择标记；目的基因都是商品化的；完全隔绝，无其他物种不利基因的漂移；无环境污染，要通过中试，环境释放，生产试验，生产证书申报。 问题： 1、表达水平1％要吃多少/天？ 2、外源的疫苗蛋白经过消化、水解，如何保持疫苗活性？

植物的遗传学特征 1、具有自我受精的遗传特性； 2、基因的突变或重组、缺失，遗传后果易于观察到； 3、植物受到机械损伤后，易在伤口处长出愈伤组织的软组织； 4、植物细胞以纤维素组成细胞壁，通常不能直接吸收外源DNA，用纤维素酶处理植物细胞，制备原生质体即可吸收外源DNA分子； 5、植物染色体以多倍体形式存在，并导致体细胞变异频率高。

植物基因工程的主要内容 1、从种类繁多的植物群体中分离有用的目的基因； 2、寻找或构建有价值的克隆载体； 3、将重组载体通过体外转化等方法导入植物受体细胞，并整合到寄宿染色体基因组上； 4、使获得带有外源基因的重组载体 DNA的植物细胞或组织，再生成形态正常的健康能育的植株； 5、通过植物的有性过程，将良好的外源基因持续传递给后代。

第二节 植物基因的克隆与分离 一、根据基因的功能分离目的基因 二、根据mRNA特异性分离目的基因 三、根据DNA的插入作用分离目的基因 第二节 植物基因的克隆与分离 一、根据基因的功能分离目的基因 二、根据mRNA特异性分离目的基因 三、根据DNA的插入作用分离目的基因 1）DNA标签法： 人为的给目的基因加上一段已知的序列标签。等于 DNA分子探针； 2）T－DNA标签法： 它是高等植物中一种非常有效的插入诱变剂和基因的标签。

第三节 植物基因工程研究常见的基因 1、选择标记基因 2、报告基因 3、抗虫抗病基因 4、非生物胁迫抗性基因 5、产物质量修饰基因 第三节 植物基因工程研究常见的基因 1、选择标记基因 2、报告基因 3、抗虫抗病基因 4、非生物胁迫抗性基因 5、产物质量修饰基因 6、其他性状基因

第四节 植物基因转移的载体 一、病毒载体 1）单链RNA病毒 2）双链DNA植物病毒 3）单链的DNA病毒 二、质粒载体 1）病源土壤杆菌 第四节 植物基因转移的载体 一、病毒载体 1）单链RNA病毒 2）双链DNA植物病毒 3）单链的DNA病毒 二、质粒载体 1）病源土壤杆菌 2）植物冠婴病的诱发与细胞突增 3）Ti质粒的一次遗传特性 4）T-DNA的结构与功能 5）应用Ti质粒载体转移外源基因与生产转移基因植物

病毒载体的优点 1）植物病毒对宿体的感染是系列的，它能将基因组扩散到被感染植株的所有细胞； 2）可以解决象玉米这样单子叶植物的外源基因的导入问题； 3）重组病毒利用植物来生产大量外源蛋白。

病毒载体 1）单链RNA病毒：90％具有感染力的正链RNA（mRNA)； 2）双链DNA病毒：花椰菜花病毒组是唯一的一群以双链DNA作为遗传物质的病毒，寄主范围狭窄； 3）单链DNA病毒：在同一个蛋白质外壳内存在两条各长2.5Kb的单链DNA,单链A编码病毒外壳蛋白与复制有关的蛋白质，单链B则编码控制病毒从一个细胞转移到另一个细胞的运动蛋白。

二、质粒载体 1）病源土壤杆菌 2）植物冠婴病的诱发与细胞突增 3）Ti质粒的一次遗传特性 4）T-DNA的结构与功能

2、冠婴瘤细胞的特性 1）具有异常的失控生长能力，组织培养的冠婴细胞在无补加的植物激素下，也能生长良好； 2）它的细胞壁长有若干特异性抗体位点，细胞壁上果胶部分的甲基化程度比正常细胞高得多； 3）冠婴组织嫁接到健康植株上能形成新的冠婴肿瘤。

Ti质粒的遗传特征 三种诱发冠婴瘤的遗传成分： 1）T-DNA：是一种移位单元，是基因组中被转移并整合到染色体上的特定DNA片断。 2）Vir基因：编码反式作用蛋白质，是植物细胞转化的必要因子。 3）间接参与植物转化的基因，其表达产物功能是使细菌结合到感染细胞的创伤部位。

Ti质粒的遗传功能 1、为根瘤土壤杆菌提供附着与植物细胞壁的能力； 2、参与寄主细胞制造植物激素（生长素和分裂素）的能力； 3、决定所诱导的肿瘤的形态特征和冠婴碱成分； 4、赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠婴碱化合物的能力； 5、赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性； 6、决定宿主菌株的植物寄主范围； 7、具有对噬菌体的排外性，抑制噬菌体的生长与发育。

T－DNA的结构与功能 结构： 存在于植物细胞核中，占Ti质粒DNA的10％，控制三套基因：tms、 tmr、 tmt。 功能： 1）随机整合在植物基因组不同位点上； 2）整合胭脂碱T－DNA分子，简单、以单一片段形式存在； 3）整合章鱼碱T－DNA分子，复杂、分开两片段形式存在。

Ti质粒载体的应用 1）将目的基因DNA与Ti质粒构建重组的质粒分子； 2）将重组载体分子转化大肠杆菌； 3）通过细菌结合作用使外源DNA的iV重组质粒从大肠杆菌转移到根瘤土壤杆菌，外源DNA从iV转到Ti质粒上； 4）将根瘤土壤杆菌接种至植物伤口部位，或用原生质体共培养方法转化植物细胞； 5）经过愈伤组织或原生质体培养，再生出转基因植

第五节培育转基因植物的实验方法 1、Ti载体的改造与构建 2、根瘤土壤杆菌转化 3、植物细胞的转化 1）根瘤土壤杆菌介导的植物细胞转化 2）生物弹击法 3）化学刺激法 4）电穿孔法 5）显 微注射法 6）脂质体法 4、转基因植株的再生

8、 转基因植物的安全性评价 从20世纪70年代重组DNA技术创建到1983年第一株转基因烟草获得以来，国际上对转基因作物就存在着截然不同的观点。 有人认为转基因作物造福于人类， 有人认为转基因作物可能给人类带来环境、健康与生态的危险。 基因工程技术在整个世界引起极大的关注与争议，并且随着转基因作物的成功获得、商品化、负面现象频繁出现等，甚至有完全拒绝转基因食品进入市场的举措.

有关事件: ①纽约大学研究人员发现，在室内种植的转基因B2玉米植株中的杀虫毒素可以渗入到 土壤中，在玉米根系周围土壤提取物中仍含有Bt毒素，可以杀死幼虫，其活性可持续25 天。研究人员认为此毒素普遍地影响土壤生态学。(1999年) ②孟山都公司培育的抗虫转基因棉花在1996年进行大规模种植，部分地区出现大量存活的棉铃虫，导致棉花不同程度地受害，需要追喷杀虫剂。 ③孟山都公司开发的抗除草剂草甘膦转基因棉花于1997年大规模种植，棉花主产区Detta收获的棉花多大量落铃或棉桃畸形。 ④世界上第一个商品化生产的转基因烟草由于销路问题已停止推广。 ⑤1994年美国第一个批准商品化的延迟成熟期的转基因番茄也因种种原因停止了生产。 ⑥苏格兰P—owett研究所用转凝集素基因的马铃薯喂饲大鼠，在电视上宣传大鼠食用后引起器官生长异常，体重和器官重量减轻，破坏免疫系统，引起国际轰动。(1998年) ⑦印度于1998年11月焚烧了美国孟山都公司的两块实验地，反对该公司的“终止技术”，即转基因作物雄性不育，农民不能自己留种。这实际上涉及到的是垄断问题。 ⑧种植抗虫转基因玉米的地区(1999年)，发现马利筋峡蝶大量减少，是蛱蝶因吮食花粉过度而死。 ⑨丹麦国立利索研究所把耐除草剂的转基因油菜籽和杂草一起培育，产生耐除草剂的杂草，转基因技术产生的基因可扩散到自然界中去。(1996年) ⑩欧盟国家决定，在新的法规制定出来之前，暂停转基因农作物的种植和流通。(2000年) ⑾大豆生产大国巴西也宣布，暂时停止生产转基因大豆。(2001年) ⑿日本政府有关部门将重新研究和制定针对转基因农作物的新的安全评估标准和项目。(2000年) ⒀绿色和平组织成员阻止装载着6万t转基因大豆的美国货轮“乔治”号通过运河船闸进入欧洲。转基因食品被大多数欧洲人认为是有害人体健康的。(2000年)

转基因植物释放后可能导致的生态学潜在风险 ①转基因入侵的风险； ②转基因通过与野生亲缘种间的基因交流而发生逃逸的风险群，使遗传性状改变，破坏生态平衡，给农作物带来严重威胁； ③抗病毒作物产生新 病毒的风险； ④转基因植物释放后对土壤生态系统及生物地球化学循环的影响风险；同时鱼类与其他动物也会受到不良影响； ⑤害虫对转B2基因植物的抗性风险，转基因植物使害虫体内产生抵御杀虫剂的抗体，反而增加了害虫的抗性； ⑥转基因植物产生的杀虫剂对非目标生物影响的风险，有可能其他小动物或昆虫也会受到株连而灭绝； ⑦转基因植物商品化后易造成生物污染；即转基因种子的“绝育”处理，进行生物垄断，带来其他作物的不育等。专家意见 1999年生物技术领域的一个热门话题就是关于转基因制品的安全性。它与现代任何一种技术一样也具有两面性，有长亦有短。 在发展转基因等生物技术时，应扬长避短，趋利避害。人类对转基因技术还需要做进一步的观察和深入的研究。 专家的意见指出，迄今，转基因技术对人类来说是利远远大于弊，绝不像有些人说的那样“毁誉参半”。 许多科学家对转基因作物寄予厚望，认为将带动一场以 “分子耕作”为基础的新型农业革命，为解决全世界的温饱问题带来希望.

相关报道: ①1999年8月出版的《自然生物技术》杂志刊文批露，德国植物生理学家罗萨·威尔密 兹和同事将酵母的蔗糖酶基因移人马铃薯，培育出转基因马铃薯新品种，每个块茎的体积是 原有品种的3倍，这项成果显示了生产大马铃薯的潜力。 ②澳大利亚一生物技术公司运用遗传工程技术培育出既耐盐碱又成为优质木材的转基因按树，可望用于保护农村和牧场免受盐碱化的侵袭。(1996年) ③有关专家认为第二次“绿色革命”——“基因革命”已经到来。 ④1999年，世界大约有1400余万公顷土地(多分布在美国、阿根廷、加拿大等)播种经基因改良的商品化作物，包括大豆、玉米、油菜籽、棉花和土豆。(1999年) ⑤美国的转基因基础研究与产业化在世界上排第一位。至1999年美国已批准50种转基因植物产品商业化，有l／4的耕地种植的是转基因作物。转基因抗除草剂大豆占美国大豆总面积的55％，抗虫棉占棉田总面积的近50％，转基因玉米占玉米总面积的30％。美国市场上已有近4000种食品来自遗传工程。(1995年) ⑥澳大利亚培育出品名为“Moondust”的开淡紫色花的转基因香石竹，因具有可人的花色和较长的切花插瓶寿命而为花卉市场注入活力。(1999年) ⑦英国成功地培育出具有去除木质素基因的白杨，从而在其用于造纸时易漂白而达到节省漂白剂和减少能耗的目的。 ⑧转基因植物所具备的“品质”，是根据人类的需要而制定的，如高产、优质、抗病 虫、耐严寒、抗高温、耐盐碱、抗倒伏、抗除草剂、提高某些成分的含量等。 ⑨欧洲专利局办公室(2001年)已确定两个有争论的转基因植物专利——由AgrEvo公司开发抗除草剂植物与Monsanto公司开发的“Flavr Savr”番茄的生效。 ⑩美国和加拿大的公众对基因改良食物的接受程度比较高。市场上的一些加工食品如软饮料、啤酒和早餐麦片等都已含有基因改良作物的成分。 ⑾德国政府同意经济界在有效监督前提下，商业化种植转基因作物。强调政府对基因技术研究和安全保障负责任，将基因技术安全性放在重要的地位。为推动转基因作物研究，德国政府推出“植物生物系统基因分析”计划，这项计划可以促使基因技术成果迅速的转化。(2000年)

对一些现象的解释: 关于斑蝶死亡之事: 是因为Bt玉米中有一种杀虫晶体蛋白是具有毒杀鳞翅目害虫的功能，而斑蝶属鳞翅目昆虫，自然会受到该蛋白的影响。 转基因作物对野生生物有利的解释: 是由于抗虫或抗除草剂基因植物的大量产生，农药与杀虫剂喷施减少就会对杂草与害虫达到完全抑制。因为杀虫剂和化肥大量用于冬麦和油料的种植是过去30年间农田鸟类和昆虫数量减少的主要原因。 安全监管，为了保障人类健康，保证后代有一个良好的生态环境，对生物技术产品可能存在的潜在危险性，各国根据国情而制定了“国家生物安全管理的法律、法规体系”，严格立法，使转基因植物的应用有章可循，有法可依。 联合国环境与发展大会(1992年)签署的《生物多样性公约》中就指出：“由生物技术改变的活生 物体在使用和释放时，既要考虑到其可能对环境产生的不利影响，从而影响到生物多样性的保护和持续利用；也要考虑到对人类健康的危险。为此对转基因植物必须进行安全评价，以保证使用的安全性”。 目前，在食品安全评价方面，已经完成了对 3 种转基因马铃薯、3种转基因番茄、2种转基因大豆以及转基因棉花、西葫芦、水稻、烟草和芦笋各一种的食品安 全性评价，除一种转基因大豆有致敏性，一种转基因马铃薯的安全性有争论外，其他几种转基因食品都被目前的研究证实是安全的。

我国的基因工程安全管理法规 1993年颁布了第一部基因工程安全管理法规，1996年又颁布了《农业生物基 因工程安全管理实施办法》， 明确规定转基因实验研究、中间试验、环境释放和商品化生产都应事先经过有关部门直至全国基因工程安全委员会批准。 目前，我国有30万公顷农田种植了转基因作物(主要是棉花)，比1998年增加了2.04倍，己成为第四大转基因作物种植国，并且转基因植物的研究正处于遗传工程领域研究的热点。

是福是祸 ? 转基因植物商品化带来多少福祸? 对人类是否安全? 是否会带来生态环境的负面影响? 转基因植物商品化带来多少福祸?　对人类是否安全?　是否会带来生态环境的负面影响?　 但是转基因植物科学研究前进的脚步不会因此而停顿。只会在种种社会压力与否定上，更加完善而促进技术不断的发展，科学家必将会向人类奉献更完满的基因来改造食物。

思考题 1、植物基因工程与大肠杆菌基因工程在主要环节上有何区别？ 2、T－DNA标签法的原理？ 3、植物基因的病毒载体主要有哪三类？ 4、番茄金色花叶病毒是单链的DNA病毒，外壳内两条单链DNA如何分工？ 5、Ti质粒的基本特性与功能？ 6、植物细胞的转化主要有哪些方法？ 7、什么叫转基因沉默？造成转基因沉默的主要原因？ 8、提高转基因水平的主要因素？