紫外/可见/近红外分光光度计 黄祖芳 E-mail:zfhuang@fjnu.edu.cn

概 述 分光光度法基本原理 仪器的基本构成 Lambda950结构和参数 具体应用与讨论

一、概述 分光光度法在分析领域中的应用已经有上百年的历史，至今仍是应用最广泛的分析方法之一。1862年，哈托莱（Hartolay）和贝利（Bailey）等人研究了各种溶液对不同波段的截止波长，发现与吸收光谱相似的有机物，它们的结构也相似。并且可以解释用化学方法所不能说明的分子结构问题，初步建立了分光光度法的理论基础，以此推动了分光光度计的发展。

而分光光度计在分析领域中的应用已有几十年历史。1918年美国国家标准局研制了世界上第一台紫外可见分光光度计（不是商品仪器，而且不成熟）。此后，紫外分光光度计被不断改进，很快在各个领域的分析工作取得应用。 1945年美国Beackman公司推出世界第一台成熟的、商品化的紫外可见分光光度计仪器。

随着分光元器件及分光技术、检测器件与检测技术、大规模集成制造技术等的发展，以及单片机、微处理器、计算机等技术的广泛应用，分光光度计的性能指标不断提高，并向自动化、智能化、高速化和小型化等方向发展。 分光元器件方面：棱镜、机刻光栅，全息光栅。 仪器控制方面：单片机、微处理器的出现以及软硬件技术的 结合，从早期的人工控制发展到自动控制。 显示、记录与绘图方面：从早期电位指示、绘图仪绘图，到 如今的计算机显示屏显示。

检测器方面：光电池、光电管，光电倍增管甚至光电二极管 阵列。 仪器构型方面：单光束，双光束 仪器向小型化、数字化、便携式方向发展 满足环境、野外、海洋等现场分析测试需要 较典型的代表有：海洋公司（Ocean Optics）和美国HACH公司，国内的普析通用（北京）小型，模块化的光纤光谱仪

(Ocean Optics) Ocean Optics

HACH 北京普析通用

二、分光光度法的基本原理 紫外可见吸收光谱的形成 原子或分子中的电子，总是处在运动状态中，每一种运动状态都具有一定的能量，属于一定的能级。在各种外界条件的激发下，以光或热的形式释放出能量。从而实现能级的跃迁，同理，当这些电子吸收了外界的辐射能量后，就会从能量低的能级跃迁到能量高的能级。 物质的分子吸收光谱形成的机理，就是由于能级之间的跃迁所引起。

一个分子的总能量 分子吸收外来辐射能量，能量改变为： 其中： 当分子发生电子能级跃迁时，不可避免的发生振动能级间的跃迁，而发生 电子能级跃迁和振动跃迁时，不可避免的发生转动能级之间的跃迁，因此， 得到的为带状光谱。

定量分析的基础----------比耳定律 几乎所有的光学分析仪器（紫外可见分光光度计，原子吸收分光光度计，液相色谱仪的紫外检测）的原理都采用朗伯-比耳定律（简称比耳定律） A为吸光度；I0为入射光强；I为透射光强；b为液体厚度；K0为消光系数，C为摩尔浓度

或表达为： 其中， 为溶液浓度为1mol/L，光程b为1cm时的吸光度， 的变化范围是10～105， >104为强吸收， <103为强度小的吸收

三、仪器的基本构成 一、电光源系统 光源部分：紫外可见分光光度计的光源一般为氘灯和卤钨灯两种。 氘灯提供紫外波段使用的光源，发光的波长范围一般为190-400nm，常见的使用波段为190-360nm左右。另外氘灯在486.0nm、583.0nm和656.1nm三处各有一根特征谱线，其中656.1nm常用于仪器定标波长。 氘灯为易耗件，一般使用寿命为：国产氘灯500-800h；进口氘灯为1000h（少数达2000h）另外跟电源设计的好坏有关。我国国家标准规定，如果新的灯测试数据为100，那么能量不足新灯的45%，则被认为寿命到期。

氘灯寿命(Heraeus)

电源部分：略

二、外光路系统 外光路系统一般由光源、反射镜或透镜组成。反射镜一般采用凹面反射镜，作用是将光源发出的光成像在单色器的入射狭缝。 外光路系统形式：

三、分光系统 分光系统是紫外可见分光光度计的核心部分。主要由入射狭缝、准直镜、光栅和出射狭缝等组成。 狭缝作用：入射狭缝限制杂散光进入，出射狭缝限制光谱带宽； 准直镜：从入射狭缝进来的复合光变成平行光 单色器：入射狭缝、出射狭缝、色散元件（光栅或棱镜）、准直镜等组成。主要技术指标包括：工作波长范围，波长准确度，波长重复性，光谱带宽，杂散光，波长扫描速度等。比较常用的有C-T型光栅单色器，两块球面镜可相互补偿慧差，具有较好的成像质量，并且增加狭缝高度不会严重影响仪器的分辨率。

四、Lambda950结构和参数 Lambda950仪器外观图

Pre-aligned for fast replacement and maximum uptime For ultra-low stray light performance Second sampling area houses a range of snap-in modules Precise Adjustment of beam height For sensitive and accurate measurements on highly absorbing samples Provide full-range UV/Vis/NIR coverage from 175 – 3300 nm Largest sample compartment in the Industry 4-segment design increases measurement accuracy Corrects for inherent instrument polarization

Chopper 黑区/样品/黑区/参比循环

仪器主要参数指标 型号 Lambda950 Lambda900 Lambda650 原理 双光束，双单色器，比率记录 光学系统 全反射光学系统（SiO2涂层）全息光栅1440刻线/mm UV/VIS，闪耀位置240nm，360刻线/mm，NIR，闪耀于1100nm 全反射光学系统（SiO2涂层）全息光栅1440刻线/mm UV/VIS，闪耀位置240nm， 全反射光学系统（SiO2涂层）全息光栅1440刻线/mm UV/VIS，闪耀位置240nm 光束分光系统 斩光器（46Hz，周期：暗/样品/暗/参考）CSSC技术 探测器 R6872光电倍增管（UV/VIS区域） 半导体冷却的PbS探测器（NIR）

光源 Pre-aligned 钨卤素灯和氘灯 波长范围 175nm-3300nm 175nm-900nm 190nm-900nm 分辨率 ≤0.05nm(UV/VIS) ≤0.20nm(NIR) N/A ≤0.17nm(UV/VIS) 波长精度 +/-0.08nm UV/Vis +/-0.30nm NIR +/-0.08nm +/-0.15nm

软件操作 UV WinlabV5 由两个主要部分组成：资源管理器和工作区。 在UV Winlab的界面上可看到三个分栏，如下图所示:

UV winlab中添加仪器 采集数据前，必须在UV Winlab中添加仪器，仪器从UV winlab的资源管理器里添加，如下图示: Instrument‥

UV winlab中添加方法 方法是对样品进行何种分析测试的设定。方法包含仪器参数的详细设定、是否使用附件及其设置、样品状况的记录表、结果数据的处理和输出报告，常用的方法有：Scan，Timedrive，Wavelength quant，Wavelength program，Polarization scan等。 Timedrive：设置项目包括，分析波长，纵坐标类型和狭缝宽度，另外还有两个时间设定：time interval(测量的时间间隔)和 total time。

方法设置 数据采集（Data collection） 设置扫描范围，开始（start）值必须大于结束值（end） 纵坐标类型可选择的有：A，T%，E1(样品光路能量值)，E2（参考光路能量值），R% 仪器页面（Instrument） 狭缝宽度（Slit width）0.5、1、2或者4nm。通常所选择的狭缝宽度为所测量的谱带宽度的五分之一到十分之一。 数据间隔（Data interval）采样的数据间隔

校正页面（Correction） 校正用来规定多长时间采集一次基线，基线的类型，反射设置和吸收光度设定。 设置基线校正模式： Always at task start Always before next measurement As required at task start As required before next measurement

数据处理(Processing) 处理程序是UV Winlab当中特色部分。处理程序允许在某些方式下改变光谱，或者另一个光谱可以从原始的光谱创建。具体操作步骤： Processing页面，点击“Add”，增加一个处理步骤，也可以增加多个，处理步骤排列的顺序就是它们被执行的顺序。因而可以针对性的进行“Up，Down”调整。可选择的处理选项有： Arithmetic，数学计算，即把光谱当数字一样进行运算。 Convert X 横坐标转换(nm和cm-1) Convert Y 纵坐标转换

Derivative 求导，导数光谱 使用光谱求导的目的：谱带没有完全分开时，判断谱带的中心点；或定量分析时，用来减少带宽的影响。 Difference 差谱 Interpolate 插值 Normalize 归一化 Peak Table 峰值表 Smooth 平滑 Equation 方程式

Universal Reflectance Accessory 附件介绍 Universal Reflectance Accessory URA 可变角镜面反射模块。工作参数： 角度范围：8度-68度，测绝对或相对反射 波长范围：3100nm-190nm 样品尺寸：8mm-150mm，3mm-8mm之间的可用 custom-made sample holder

150 MM Intergrating Sphere Reflectance Accessory 积分球是内置漫反射附件。工作参数： 波长范围：2500nm-190nm 样品尺寸：8mm-150mm，3mm-8mm之间的可用 custom-made sample holder

Specification

五、具体应用与讨论 1、定量分析 紫外分光光度计的应用领域涉及制药、医疗卫生、化学、环保、食品、生物、材料等领域。 绝对法： 标准法：相同测试条件下，分别测试标准样品溶液和被测样品 溶液的吸光度值A标和A样，然后计算。

标准曲线法：紫外可见分光光度计最常用的定量分析方法是标准曲线法,即先用标准配制一定浓度的溶液,再将该溶液配制成一系列的标准溶液。在一定波长下，测试每个标准溶液的吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。将测试样溶液吸光度值按曲线的位置查找出对应的浓度或含量。 原则上所配制的标准溶液的吸光度在0.1-1.5A范围内，吸收光度精度可达0.5%，值得注意的是，分析测试不是千篇一律的按照此标准，主要还跟仪器的参数特性有关。仪器杂散光指标尤为重要。

最小二乘法：实际上也是回归方程法，因为，分光光度法中试样的吸光度A与试样的浓度C之间的关系可用方程，C=aA+b描述，如果做标准曲线时求出的回归方程差，相关系数（R）不好，测定量误差就很大。因此，提出应用最小二乘法。 应该注意两点： 1、回归方程是在特定条件下求得的，不能随便套用 2、分光光度法中试样的吸光度与试样的浓度C之间的关系， 应建立在回归方程中的取值范围内，否则，不能随便外推。

1.1生命科学领域的应用 蛋白质分析工作中的应用：蛋白质含量的检测，基于蛋白质对紫外光的主要吸收波长为280nm

2、定性分析 某个未知物的紫外吸收光谱如果峰较多，结构复杂，那么只用分光光度计是不能作为定性分析的，必须还要有色谱、红外、质谱、波谱等多种仪器的联合使用，才能做定性分析。 如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点等完全一样，就可初步判断未知物与标准物是同一种物质，当然不排除特殊情况。 利用波长位置判断有机化合物的生色基团

3、学习与讨论部分 1、双光束比单光束好? 价格上，一般双光束比单光束贵。 光源波动方面，双光束可以抵消波长引起的误差，而普遍认为单光束不能，光源带来的影响有多大？而且光源的设计也在发展，对于单光路设置采集数据多次取平均能否改善？ 能量方面，双光束由一束变两束，能量减半？ 双光束的信噪比，光度准确度，基线飘移等都比单光束好。

2、透过率T%与吸光度A的关系

3、影响比耳定律偏离的主要因素 非单色光 理论分析建立在单色光的基础，仪器上不可能得到真正的单色光。 杂散光 大部分来自光栅，另外外光路。高浓度时，影响更严重；此外， 不少物质还会产生光致发光或产生荧光，也会导致比耳定律偏离。 噪声 噪声限制紫外可见分光光度计对样品浓度分析的下限，主要来自 电子学系统，正负噪声分别带来吸光度值增大和减小的影响。 化学因素

4、比耳定律的可靠性 实际的分析条件有偏差，在使用中就会出现可靠性的问题。 （一）非单色光 （二）吸光物质成分之间的相互作用 原先的假设是吸光粒子相互无关，实际只存在稀溶液（浓度≤0.01mol/L），在高浓度时，容易产生聚集、聚合等现象，从而影响吸光度；并且，粒子之间的相互作用改变了粒子本身的电荷分布，从而改变对所吸收的入射光能量的要求，导致吸收峰位、形状、高度等随浓度增加而改变。 （三）光程不等 照到样品或溶液比色皿上的光存在一定的夹角，导致光程改变。 比色皿匹配的问题。

5、吸光度值在什么范围里最准确? 一般认为吸光度在0.2-0.8之间误差小,在0.434处最小。有一个问题,如果吸光度在0.8以上,或者在0.2以下，是否有必要将溶液浓缩或稀释而让其吸光度在0.2-0.8的范围内?

6、光谱带宽与狭缝宽度 光谱带宽以nm计，而狭缝宽度以mm计，经常有称分光光度计仪器的狭缝宽度为多少纳米，原则上是不正确的，但实际大家都这么用。

7、光度准确度(Accuracy)和光度精密度(Precision) 准确度：测量值与理论值之差，偏差越小说明测量结果越准确可靠。 精密度：连续重复多次测量某一吸收峰值，其中最大值与最小值之差。 差值越小，说明仪器的光度重复性越好。 (a)精密度，准确度都不好 (b)精密度好，准确度差 (c)精密度差，准确度好 (c)精密度，准确度好

8、吸光度A为负值

参考书目

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