分光光度计（荧光/紫外可见） 培训 张文静 wenjing271@126.com 牟平海岸带环境综合测试站 2017年06月16日.

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1 分光光度计（荧光/紫外可见） 培训 张文静 牟平海岸带环境综合测试站 2017年06月16日

2 光谱分析法

3 荧光/紫外分光光度计 荧光分光光度计 HITACHI F-2700 紫外可见分光光度计 TU-1810
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

4 报告提纲 紫外可见分光光度计 一 荧光分光光度计 二

5 原理——朗伯比尔定律 当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。 A ——吸光度；τ——百分透射比；K ——比例常数；B ——液层厚度； C ——溶液浓度。

6 紫外可见分光光度计 工作模式：单机模式，单片机软件平台
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 工作模式：单机模式，单片机软件平台 光谱宽度：2nm（固定狭缝） 波长范围： nm 波长重复率：≤0.2nm 波长示值误差：±0.3nm（开机自动校准） 光度方式：透过率、吸光度、能量 光度范围：-0.3Abs～3Abs 透射比示值误差：±0.3% 透射比重复率：≤0.15% 基线平直度：± 漂移：≤0.2%/h

7 仪器构造 单 色 器 样品 吸收池 信号显示系统 检 测 控制系统 光源 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 由光源发出的光，经单色器获得一定波长的单色光，照射到样品溶液，被吸收后，经检测器将光强度变化转变为电信号变化，并经信号显示系统调制放大后，显示测量结果。

8 功能——光度测量 测量当前波长处的吸光度或透过率并可进行系数计算； 利用光度测量功能测量当前波长处的吸光度或透过率；
若选定自动八联池状态，可自动完成校准及7个样品的测量。 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

9 功能——光谱测量 可对样品的吸光度、透过率和灯能量进行光谱测量。 设置参数，如波长范围、显示范围、采样间隔及扫描速度等；
可扫描出样品的光谱曲线，并在LCD显示器上实时显示。 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

10 功能——定量测量 可进行单波长的定量测定，定量方法有系数法和标准曲线法； 可作8个标准样品的标准工作曲线并给出线性相关系数；
可输入线性系数可直接进行样品浓度测量。 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

11 功能——DNA/蛋白质测量 方法1： 蛋白质浓度 ＝ 1552×A280－757.3×A260 (ug/ml)
方法2： 蛋白质浓度 ＝ 183.0×A230－ 75.8×A260 (ug/ml) DNA浓度 ＝ 49.1×A260－3.48×A230 (ug/ml) 自定义法： 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

12 功能——系统应用 在此功能模块下，可进仪器的工作参数进行设置，如换灯波长、狭缝的大小、钨灯和氘灯的开关、模式设置、时间设置和系统复位等。
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

13 应用领域 环境保护 化学工业 冶金地质 生物化学 机械制造 临床检验 食品卫生 药品检验 农业化学 国防科学
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

14 报告提纲 紫外可见分光光度计 一 荧光分光光度计 二

15 荧光分光光度计 HITACHI F-2700 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子 吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光. 不同物质由于分子 结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 1. 光源： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 2.激发单色器： 置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。 3.发射单色器： 置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。 4. 样品室： 通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排;测量固体时，光源与检测器成锐角安排。 5. 检测器： 一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。

16 原理—分子发光机理 M + hν M* M+热 M+荧光 S2 S1 S0 F = KI0CL = K’CL Singlet State
Internal Conversion Fluorescence Absorption Singlet State M + hν M* M+热 M+荧光 基态 激发态 F = KI0CL = K’CL : 荧光效率，K：仪器常数, C：浓度，I0：吸收光强，L：池的光径长度

17 仪器构造 紫外检测器 1)荧光分光光度计有两个单色器,而紫外只有一个单色器 2）荧光分光光度计的光源和检测器是成直角分布的,而紫外是成一条直线的. 除了以上两点之外还有两点区别：3)荧光分光光度计是以氘灯做为光源,而紫外是以氢灯或氘灯作为紫外区光源,钨灯或卤钨灯作为可见光区的光源 4）荧光分光光度计的比色皿是四壁均为光学面,而紫外仅为两面为光学面. A.90角接收光信号——去除透射 B.两个单色器（选择激发光单色器、分离荧光单色器）——去除杂散光

18 特点 灵敏度高 比紫外高2-3个数量级 选择性强 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。因此确定恰当的激发光谱和发射波长，能达到很高的选择性
灵敏度高 比紫外高2-3个数量级 选择性强 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。因此确定恰当的激发光谱和发射波长，能达到很高的选择性 试剂量少 方法简单 可连接微机工作站，能获得更多信息 荧光分析可提供激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧光量、峰位、普带宽度、量子产率和荧光寿命等参数 受外界影响大 温度、pH值、溶剂和其他因素都可能显著影响分析结果。温度对其影响最大

19 荧光分光光度计的功能 1、波长扫描  波长扫描功能主要包括荧光强度和发光强度两种数据模式。通过荧光强度数据模式可以得到样品的激发光谱和荧光光谱，是一种比较常用的方法。 300 320 340 360 380 400 420 440 460 nm 50 100 150 200 250 350 INT Excitation scan emission 402 nm Emission scan excitation 358 nm Anthracene 荧光光谱：选择合适的激发波长（根据物质激发光谱曲线来确定），固定激发光波长，然后测定不同波长时所发射的荧光强度。

20 荧光分光光度计的功能  2、时间扫描 时间扫描是在规定的时间间隔内采集被测样品的荧光强度随时间 变化曲线。可以用来监测被测样品的物理化学变化，动力学法可被执 行。  3、光度值法  使用波长法进行定量，高达20个标准样品能被测量，通过标准浓 度的每个点来绘制多边形标准曲线，回归标准曲线的制备可使用一次 、二次、三次方的曲线或折线，同时可获得其相关系数R及R2。  4、三维扫描  可以得到三维图、等高线图，快速进行未知样品荧光峰位的测定。  5、强大的图谱处理功能  两个谱图可进行加、减、乘、除运算，也可以计算谱图面积；具 有光谱校正和快门控制等。 1 灵敏度高 比紫外高2-3个数量级 2 选择性强 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。因此确定恰当的激发光谱和发射波长，能达到很高的选择性 3 试剂量少 方法简单 由于灵敏度高 4 能获得更多信息 荧光分析可提供激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧光量、峰位、普带宽度、量子产率和荧光寿命等参数。 5 受外界影响大。 温度、pH值、溶剂和其他因素都可能显著影响分析结果。温度对其影响最大。

21 应用领域 生物化学测定 酶动力学测定及底物测定 药物学方面 Intracellular Biochemistry (细胞内离子动态测定)
免疫学测定及研究 生物膜研究（偏振）(Polarization) 1.医学和临床检验———生物体试料的临床分析  2.药学和药理学———天然药物分析，药品质量控制和药物代谢的研究  3.生物化学———对于生物体内微量物质的测定  4.食品工业———食品中痕量组分的测定  5.污染物的分析———大气污染、环境卫生检测，食品污染物研究等  6.有机和无机化学———用吸光光度法不能测定的痕量组分分析

22 显微镜+拍照系统 OLYMPUS CX31 OLYMPUS CKX41 OLYMPUS BX53 OLYMPUS SZ
1 灵敏度高 比紫外高2-3个数量级 2 选择性强 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。因此确定恰当的激发光谱和发射波长，能达到很高的选择性 3 试剂量少 方法简单 由于灵敏度高 4 能获得更多信息 荧光分析可提供激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧光量、峰位、普带宽度、量子产率和荧光寿命等参数。 5 受外界影响大。 温度、pH值、溶剂和其他因素都可能显著影响分析结果。温度对其影响最大。 OLYMPUS BX53 OLYMPUS SZ

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