离子通道与受体 主讲:张玉芹
离子通道
在活细胞中,离子通道可将不同刺激的能量转换成电信号,每个可兴奋细胞膜中都有很多离子通道。 电压门控性通道 离子通道 包括 化学门控性通道 机械门控性通道 在活细胞中,离子通道可将不同刺激的能量转换成电信号,每个可兴奋细胞膜中都有很多离子通道。 一、为什么离子不能通过脂质双分子层而必须通过离子通道? 水分子是双极性分子,氧原子吸引电子带负电荷,氢原子趋向失去电子带正电荷。
水溶液是一种极性环境,阳离子吸引在氧原子上,阴离子吸引在氢原子上。离子与水相互吸引,离子被带静电的水包绕着,被水包绕着的离子与细胞膜中的疏水区是不相溶的补可能从膜中自由通过。
二、离子通道的现代研究方法: -结构和功能的研究 (一)功能研究: -膜片钳patch clamp技术应用 膜片钳技术是研究单通道功能的重要方法。20世纪70年代(1976年)德国的科学家 Bert Sakmann 在电压钳技术的基础上,发明了膜片钳技术,80年代得到进一步改进和完善。
1、膜片钳技术要点: ①对被测细胞进行预处理(酶消化)保持膜清洁。 ②用直径0.5-3微米尖端抛光的玻璃微电极与被测细胞接触。 ③封接 使微电极与一小片细胞膜接触通过电极内负压吸引而封接封接电阻可达几亿兆欧,与细胞的其它部分在电学上完全隔离开来,用微电极记录到的膜电流只与这一小片膜通道分子功能有关。 ④人为钳制膜电位可定量分析通道性质和功能。 举例:
2、膜片钳构型(configuration) 膜片钳是一种能测定单离子通道(single ion channels)电生理新研究技术 (1)细胞贴附式(cell attached mode): 这种构型适用于在完整的细胞膜上(全细胞)测定单通道电流,用于研究某些特殊物质,如神经递质(加入到细胞浸溶液中),引起通道的改变(调制或调节作用)。
(2)全细胞膜片钳或称穿孔膜片钳(perforated patch whole cell mode): 这种构型是将玻璃微电极下的膜吸穿(负压),通过电极记录的电流是整个细胞每个通道电流的总和。因此,全细胞膜片钳测定的电流为大电流(macroscopic current)(全细胞电流)。
(3)膜外向外膜片钳(outside-out patch clamp): 这是微电极下膜片与细胞脱离,但膜片与微电极尖顶仍保持高电阻封接的,研究单通道电流的两种膜片钳中的一种。这种膜片钳适用于研究配体,如神经递质、激素或通过膜外作用的药物对通道产生影响。配体必须加入浸浴液中,其原因是浸浴液比微电极中的溶液更易于更换。这一种膜型适用于一些较为复杂的实验研究,如剂量一效应关系等。
(4)膜内向外膜片钳 (inside-out patch clamp): 这是膜片与细胞脱离,研究单通道的第二种模式。通常用于特定细胞研究第二信使参与通道活性的调制作用,将所要研究的物质加入浸浴液,直接作用于细胞浆膜的内侧面。
(二)结构研究-分子生物学方法 生物膜上的离子通道是什么样子?怎样跨越膜?通道开或关结构发生了什么变化?药物和递质与通道什么部位结合?这是结构研究的主要内容。 离子通道是较大的糖蛋白分子(分子量2.5-25万)。所有通道都跨过整个膜的厚度。有四级结构。二级结构主要是指α螺旋、β折叠和β转角等。
(1) 结构的测定: 通道的一级结构可用Edman降解法和重组DNA方法分析测定;利用计算机可从一级结构预期二级结构;x线晶体衍射图象可确定三级结构。 (2)结构的检验: 免疫组化法:因为抗体可选择性结合于通道分子中相应的肽,从抗体结合发生的部位可确定通道的特异区域在膜的内表面或外表面。 基因工程法:根据不同种族的同一通道基因产生想象中的通道再与最初的通道进行比较分析通道不同部分的功能。 (3)制造离体定点突变 (site-directed mutagenesis)
三、通道状态及开闭的控制因素 (一) 通道的状态: 备用、激活、失活 备用 激活 失活
(二)控制通道开闭的因素有: 1、门控机制 (1)电压门控通道结构中有一个特定的电荷区当跨膜电位改变时,电荷区受电场影响而移位,从而导致通道构象改变。引起开闭。 (2)化学(配基)门控 特定的化学物质与通道受体结合导致通道开闭。 (3)机械门控 当细胞收到牵拉时通道蛋白勾象改变。
2、失活机制 电压门控通道和化学门控通道都有不应期。 处于不应期则为失活状态。备用状态和失活状态通道的构象是不同的。 3、通道开闭的速度 小于10 μs
四、离子通道的特性 1、无论是电压门控通道还是配基门控通道 其“开放”和“关闭”都是突然发生的。 2、通道只有“开”和“关”两种状态很少有 “半开”或部分“开”的情况。 3、离子通过通道都是被动的,不消耗能量。 4、通过通道的离子流有饱和性。 5、通道可被某些物质阻断。 6、离子通道有电荷选择性(特异性)。
五、电压门控通道 (1)Na+通道 由一个α亚单位和2个β亚单位构成。α亚单位是一个跨膜多肽,可与河豚毒结合,从而阻断Na+通道。 2个β亚单位附在α亚单位上。 Na+通道有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,在CNS中多为Ⅰ型。 Na+通道有备用、激活和失活三种状态。有髓纤维Na+通道主要密集在郎飞氏结处
(2)K+通道 有电压依赖性K+通道如延迟外向整流K+通道(与AP Ca2+激活K+通道、 受体耦联K+通道、 其它K+通道(如ATP敏感K+通道) Na+激活K+通道 细胞容积敏感K+通道(细胞肿胀时开放)
(3)Ca2+通道 受体活化Ca2+通道 第二信使活化Ca2+通道 机械活化Ca2+通道 静息活化Ca2+通道 电压依赖性Ca2+通道有L-型、T-型、N-型、P-型。 受体活化Ca2+通道 第二信使活化Ca2+通道 机械活化Ca2+通道 静息活化Ca2+通道
(4)电压依赖性钙通道的分子生物学 在各种钙通道中,对L-型通道的分子结构研究较深入。利用与双氢吡啶类化合物(DHP)特异性结合的特性,将通道蛋白纯化、克隆,进行分子结构分析,初步弄清了L-型钙通道的结构。
L-型钙通道是由3种蛋白质亚单位(α、β、γ)构成的高分子糖蛋白复合体。清除双硫键后,α亚单位可分为α1和α2。除了α、β、γ亚单位外,还有δ亚单位附着于α2上。α1亚单位含有1873个氨基酸,分子量为170 KD;α2有1106个氨基酸,分子量为150 KD。β与γ分别有524和222个氨基酸,分子量分别为55 KD和32 KD,β亚单位为非糖多肽,δ亚单位为18.4 KD的糖多肽,氨基酸数目不明。
受 体
一、信息物质 信息物质,信息分子 细胞间信息物质 细胞内信息物质 (一)细胞间信息物质 细胞间信息物质—由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质。
分类: 按化学本质分 蛋白质和肽类 氨基酸及其衍生物 类固醇激素 脂酸衍生物 NO
按作用方式分 局部化学介质 旁分泌信号 生长因子 NO 激素 内分泌信号 神经递质 突触分泌信号 乙酰胆碱 自分泌信号 癌蛋白
(二)细胞内信息物质 细胞内信息物质—在细胞内传递细胞调控信号的化学物质 无机离子 Ca2+ 脂类衍生物 DAG Cer 糖类衍生物 IP3 核苷酸 cAMP cGMP 信号蛋白分子—多数为癌基因的产物 Ras
通常将Ca2+ 、DG、IP3、cAMP 、 cGMP等这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使(secondary messenger) 方式 酶促级联反应 所有的信息物质在完成信息传递后,必须立即灭活
二、受体 受体(receptor)—是细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合,进而引起生物学效应的特殊蛋白质,个别是糖脂。 配体(ligand)—能与受体呈特异结合的生物活性分子 细胞间信息物质即是一类最常见的配体
(一)受体的分类、一般结构 受体分类: 根据部位分: 膜受体 、胞内受体 根据功能分:促离子型受体 促代谢型受体 根据配体分:胆碱能受体、肾上腺素能受体 等
(2)七个跨膜α螺旋受体 蛇型受体 其胞浆面第三个环能与鸟苷酸结合蛋白相偶联 1、膜受体 水溶性物质与膜受体结合 (1)环状受体 即配体门控离子通道 神经递质 (2)七个跨膜α螺旋受体 蛇型受体 其胞浆面第三个环能与鸟苷酸结合蛋白相偶联
鸟苷酸结合蛋白(简称G蛋白)是一类和GDP或GTP结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白 由三个亚基组成α、β、γ 两种构象 活化型(GDP)、非活化型(GTP) 效应酶 腺苷酸环化酶(AC) 磷脂酶C(PLC)
激动型G蛋白(Gs) 抑制型G蛋白(Gi) 磷脂酶C型G蛋白(PI-PLC) 耦联肾上腺素受体 胰高血糖素受体 耦联腺苷受体、阿片受体 胰岛素,催产素,血管紧张素受体 磷脂酶C型G蛋白(PI-PLC)
(3)单个跨膜α螺旋受体 糖蛋白/且只有一个跨膜螺旋结构 酪氨酸蛋白激酶受体型 催化型受体 胰岛素受体 表皮生长因子受体 非酪氨酸蛋白激酶受体型 生长激素受体 干扰素受体 基本结构 胞外区 配体结合区 跨膜区 疏水区 细胞内 近膜区和功能区
(二)胞内受体 胞内受体多为反式作用因子 类固醇激素、甲状腺素、维甲酸 结构:高度可变区 N端 转录激活作用 DNA结合区 富含半胱氨酸 激素结合区 C端 配体结合区 激活转录
(三)受体作用的特点 结构高度专一性 高度亲和力 可饱和性 可逆性 特定的作用模式 具有放大效应 7. 生物体存在内源性配体
三、受体活性的调节 受体数目/受体对配体亲和力 受体上调: 受体上调指由于受体数量增多或受体对配体亲和力增加从而使靶细胞对配体的刺激反应过度。长期使用拮抗剂,出现受体数目增加 受体下调: 受体下调指由于数量减少或受体对配体亲和力降低从而使靶细胞对配体刺激的反应减弱或消失。长期使用激动剂,可使受体数目减少。
常见机制 磷酸化和脱磷酸化 膜磷脂代谢的调节 酶促水解作用 G蛋白的调节
四、受体介绍 (一)乙酰胆碱受体(见神经递质) 分型:M N 分布: 激动剂与拮抗剂: (二)肾上腺素能受体
(三)嘌呤受体 1、分型:嘌呤受体可以分为P1(腺苷)受体和P2(ATP)受体两种类型 。 P2又可以分为离子型的P2X和代谢型的P2Y两种 。 2、受体性质:P2X受体属于配体门控离子通道型受体,介导非选择性阳离子电导的增加,激活后可以产生内向电流。 P2Y受体则属于G蛋白偶联型受体。
3、P2受体亚型: P2X受体1994年Valera和Brake首次克隆了P2X1、2亚单位,随后又相继克隆了P2X3、4、5、6、7亚单位(共7个)。 P2Y受体目前已经克隆出P2Y1、 P2Y2、 P2Y4、 P2Y6、 P2Y11、 P2Y12 6个具有功能的亚单位。 P2Y4、 P2Y6对UTP、UDP敏感,对ATP不敏感。
P2X和P2Y受体在内脏、中枢及外周神经系统都有广泛的组织分布。 P2X受体具有两个跨膜结构域TM1和TM2,TM1和TM2之间是一个大的胞外环,其上有ATP结合位点以及拮抗剂结合位点,C末端和N末端位于胞内。
P2X受体调制: P2X受体的调制主要有两种类型,即变构调节和磷酸化调节。 变构调节位点位于胞外环,主要是一些金属离子的调制,如Zn2+对P2x嘌呤受体具有变构性调制作用。 磷酸化调节位点位于胞内,主要是各种蛋白激酶磷酸化其丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基。SP[8]和BK[9]对ATP-激活电流均具有明显的增强作用。
P2Y受体分子结构及特性: P2Y受体由308-377个氨基酸组成的蛋白质。 与其它G蛋白耦联受体一样具有7个跨膜结构域。有较长的胞外N末端,和胞内C末端。
P2Y受体 胞内转导机制: 大多数P2Y受体经G蛋白耦联,激活PLC,导致IP3形成和胞内Ca2+动员。少数P2Y受体经G蛋白耦联,激活AC。
(四)氨基酸递质的受体: 中枢神经递质大部分是氨基酸。 兴奋性递质:谷氨酸、门冬氨酸、 抑制性递质:-氨基丁酸和甘氨酸
1、兴奋性氨基酸受体: 用4种兴奋性毒素即海人藻酸(KA)使君子酸(QA)、N-甲基-D门冬氨酸(NMDA)、-氨基-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸(AMPA)和谷氨酸类似物ACPD、L-AP4区分受体。分为:NMDA受体、 AMPA受体、 KA受体、促代谢型ACDP受体、L-AP4受体。 NMDA、 AMPA、 KA为离子型受体, ACDP、L-AP4常合称为非NMDA受体。
分GABA A GABAB GABAC 3种亚型。 GABA A受体是配体门控离子通道。 结构类似乙酰胆碱,由5个亚单位组成,分子量为275KD。本质是糖蛋白。是氯离子通道受体,主要介导突触后抑制。
复习题 1、名词解释: 第二信使,受体,配体,G蛋白
2、关于G蛋白的叙述,错误的是 3、能与蛋白激酶C结合的是 4.位于核内的受体有 A.醛固酮受体 B.肾上腺素能受体 ⑴G蛋白能结合GDP或GTP ⑵ G蛋白由α、β、γ三个亚基组成 ⑶ G蛋白的三个亚基结合在一起才有活性 ⑷ 激素-受体复合物能激活G蛋白 3、能与蛋白激酶C结合的是 ⑴DAG ⑵cAMP ⑶Ca++ ⑷IP3 4.位于核内的受体有 A.醛固酮受体 B.肾上腺素能受体 C. M受体 D. G蛋白耦联受体