第八章 干细胞培养 胚胎干细胞培养和诱导分化 第八章 干细胞培养 胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞： embryonic stem cell, ES/ESC 从着床前早期胚胎或者原始生殖细胞分离得到的具有全能性的干细胞。 桑椹胚 胚胎干细胞 囊胚内细胞团（主要） 原始生殖细胞
胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞发展史： 1981年，Evans和Martin分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞； 1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞； 1998年，Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞； 1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞； 2000年，Reubinoff等建立了两株人胚胎干细胞系。
胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞生物学特征： 1 ES细胞形态结构与核型： 体积小,核大,与早期胚胎细胞相似。核型正常，具有整倍性。 2 生长特性： 生长特性:细胞紧密聚集,干细胞巢, 细胞界限不清晰。 3高度分化潜能： 具有全能型或者亚全能性，能被诱导分化成不同类型的组织细胞，包括造血干细胞、间充质干细胞等成体干细胞。
显微镜下观察的ESC
胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞鉴定： 1 形态结构鉴定：借助显微镜。 2 特异性标记分子鉴定： 1）Oct-4分子鉴定； 2）碱性磷酸酶(AKP)鉴定； 3）阶段特异性胚胎抗原：SSEA； 4）其他标记分子：TRA，干细胞因子等； 5）端粒酶活性； 6）诱导分化为各种成体干细胞。 肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60) ；OCT-4是POU家族的转录因子，仅在胚胎干细胞和原始生殖细胞内表达。
胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞的分离获取： 来源：早期胚胎内生细胞团或原始生殖细胞 （1）从早期胚胎的获得 （2）从原始生殖细胞中获得 （3）体外受精胚胎囊胚期内层细胞 （4）体细胞核转移 体内途径 体外途径
内细胞团 原生殖细胞 从早期胚胎或原始生殖细胞获得
体外受精 体外受精胚胎囊胚期内层细胞获得
体细胞核转移获得
胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞的建系： 1 ES细胞的分离获得； 2 ES细胞的分化抑制培养； 3 ES细胞系的建立及保存。
胚胎干细胞的分离培养示意图
胚胎干细胞培养和诱导分化 ES细胞的分化抑制培养： 1 饲养层培养法： 应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤细胞（SIM）作为饲养层细胞，都能促进胚胎干细胞增生和抑制胚胎干细胞自主分化。分泌抑制胚胎干细胞自主分化的因子—白血病抑制因子（LIF）。 2 无饲养层培养法： 是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或者在基础培养基上加入重组的LIF制备成条件培养基。这样也能保证胚胎干细胞增殖的同时维持未分化的二倍体状态。
胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞的诱导分化： 常用方法: ① 加入诱导细胞分化的因子或化学物质(诱导剂), 如VGEF、bFGF、DMSO和RA等； ② 将ES细胞与特定的细胞共培养； ③ 将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内。
胚胎干细胞培养和诱导分化 胚胎干细胞培养和诱导分化意义： 1．建立哺乳动物发育的体外模型 ES细胞具有全能性，是哺乳类动物胚胎发育及细胞分化和操作的理想材料。 2．生产转基因动物 利用ES细胞生产嵌合体动物既是检测ES细胞全能性的重要手段，也是生产转基因动物的主要方法。
胚胎干细胞培养和诱导分化 3．组织和器官修复 在组织工程及器官培养中的作用，进行组织和器官再造，用于治疗如帕金森氏病、痴呆症、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎等。 4．基因及细胞治疗 干细胞是基因治疗的较理想的靶细胞。
胚胎干细胞培养和诱导分化 干细胞治疗的特点： 1) 一次性介入，永久性治疗； 2) 不需要完全了解疾病发生的确切机理； 3) 可应用于自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。